实验七 利用rt-pcr分析基因表达

《实验七 利用rt-pcr分析基因表达》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、实验七利用RT-PCR技术分析基因表达一、实验目的掌握RT-PCR反应的基本原理；学习利用RT-PCR进行基因表达分析的基本技术。二、实验原理反转录多聚酶链式反应(ReverseTranscription-PolymeraseChainReaction,RT-PCR)是对特定的RNA分子进行扩增的技术，可分成两个部分：（1）将目的RNA反转录(RT）为complementaryDNA（cDNA）;（2）以此cDNA为模板进行聚合酶链式扩增（PCR）。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，如检测细胞中特异基因在mRNA水平的表达情况；检测细胞中RNA病

2、毒的含量；从mRNA直接克隆特定基因而不必构建cDNA文库等。RT-PCR可以一步法或两步法的形式进行。在两步法中，cDNA的合成首先在逆转录缓冲液中进行，然后取出部分反应产物在另一缓冲系统进行PCR；在一步法中，逆转录和PCR在同一缓冲体系中顺次进行。本实验将利用一步法对从拟南芥叶片中CaM5基因在mRNA上的表达水平进行分析。基因组DNA水平上扩增的条带大小为992bp,其中外显子为450bp,内含子为542bp.(2)mRNA水平上扩增的条带大小为450bp.三、实验材料实验五的拟南芥叶片总RNA四、实验试剂1.primeScript1st

3、epEnzymemixPrimescriptRTaseEXTaqHSRNaseinhibitor2.2×1stepbuffer10×onestepRT-PCRbufferOnestepenhancersolutiondNTPmixture3.前向引物(10uM)：5’-CGCGAATTCATGGCAGATCAGCTCACCGATGATCA-3’反向引物(10uM)：5’-AGAGCGGCCGCCTTTGCCATCATAACTTTGACAAA-3’4.1.0%琼脂糖凝胶五、实验步骤1.RT-PCR反应混合液的配制(25μl)2×1stepbuffe

4、r12.5μlprimeScript1stepEnzymemix1μl前向引物(P1)1μl反向引物(P2)1μl总RNA模板1μlRNaseFreedH2O8.5μl所有试剂按量仔细添加后，轻轻混匀，稍离心后即可，为了防止反应混合液蒸发，最后添加15μl矿物油。2、PCR仪的参数设置50℃30min94℃2min94℃30sec35cycles62℃30sec72℃30sec72℃5min3、琼脂糖凝胶电泳检测反应结束后，取5μlRT-PCR产品，加入1μl6xloadingbuffer，混匀后点样，电泳15min。六、实验结果与分析