转基因植物表达的RT-PCR检测

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1、转基因植物表达的RT-PCR检测实验原理RNA的多聚酶反应（RT-PCR）是以mRNA为模板进行逆转录反应（reversetranscription，RT）与PCR，可用于检测单个细胞或少数细胞中少于10个拷贝的RNA模板。RNA扩增包括两个步骤：在单引物的介导下和逆转录酶的催化下，合成RNA的互补cDNA，加热后cDNA与RNA链解离，然后与另一引物退火，并由DNA聚合酶催化引物延伸生成双链靶DNA，最后扩增靶DNA.mRNAcDNAPCR产物一步法：利用同一缓冲液，在同一体系中加入逆转录酶、引物、Taq酶、4种dNTP直接

2、进行mRNA反转录与PCR扩增。利用反转录酶和Taq酶作用在同一体系中直接以mRNA为模板进行反转录和其后PCR扩增，从而使mRNA的PCR步骤更为简化。所需样品量减少到最低限度，临床小样品的检测非常有利。用一步法扩增可检测出总RNA中小于1ng的低丰度mRNA。该法可用于低丰度mRNA的cDNA文库的构建及特异cDNA的克隆，并有可能与Taq酶的测序技术相组合，使得自动反转录、基因扩增与基因转录产物的测序在单管中进行。RT-PCR—一步法和两步法两步法：由于单管反应时RT和PCR都不能在最佳条件下进行并且容易相互干扰，常只适

3、宜用基因特异引物扩增较短的基因，及定量PCR。两步法则是将RT和PCR分别进行，这样使得两个反应充分发挥各自的特点，更为灵活而且严谨，适合那些GC含量、二级结构严重的模板或者是未知模板，以及多个基因的RT-PCR。RT-PCR—一步法和两步法外源基因的转录表达基因表达基因表达指基因组中某基因在细胞中转录为mRNA和翻译成蛋白质的过程。基因表达的改变预示着细胞在分子水平上的变化。它往往是细胞形态功能变化之前的变化。DNARNAProtein转录翻译目前研究转基因植物外源基因转录表达的常用方法1、RT-PCR(RNA)2、No

4、rthernblot(RNA)3、real-timePCR(RNA）反转录PCR(RT-PCR)mRNAcDNAPCROligodT,逆转录酶特异性引物,Taq酶用途:获得所需cDNA片段；检测基因表达注意问题：1、PCR效率差异，重复性2、内参选定3、共同扩增4、扩增片段位置5、mRNA丰度仪器旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，0.2mlPCR微量管，双面离心管架，PCR仪，台式离心机，琼脂糖凝胶电泳系统，水漂，恒温水浴。试剂RNA反转录酶，3U/μLTaqDNA聚合酶，PCR缓冲液（10×，MgCl2free），25

5、mMMgCl2，dNTP，引物，模板质粒pMD18-T-NK，无菌ddwater。实验操作步骤：1）RNA提取：关键防止RNA降解RNA提取的成功与否是RT-PCR检测中最重要的步骤。2)逆转录：RNA、缓冲液、dNTP、逆转录酶、引物（随机引物，OligodT;特异引物)5’AAAAAAAA3’TTTTTTTTmRNAcDNAA）在0.2mL微量离心管中，加入如下各成分总RNA2μL（1-5μg）10×PCRbuffer1μLdNTPmix（各2.5mM）2μL逆转录酶（200u/μL）0.5μLOligo（dT）或rand

6、orm9mers2μLddH2O至10μL混匀后稍离心，42℃孵育30min，99℃5min然后4℃保温5min，终止反应后置冰上。3)PCR特异性引物、模板、Taq聚合酶。（B）在0.2mLPCR微量离心管中配制20μL反应体系10×PCRbuffer（含MgCl2）3μL2.5mmol/LdNTP2μL10μmol/LPrimer11μL10μmol/Lprimer21μL模板CDNA5μL3U/μLTaq酶0.5μLddwater补足至20μL（C）根据具体的条件设置PCR仪的循环程序：（D）PCR结束后，取10μL产物

7、进行琼脂糖凝胶电泳。RT-PCR全过程AAAAAAAAAA-3’TTTTTTTTTT-5’TranscripciónreversaPCRusandoGSP+GSP1AAAAAAAAAA-3’TTTTTTTTTT-5’mRNA(sense)PrimerAntisense:oligo(dT)o1racadenacDNAGSP1(sense)GSP(antisense)GSP1GSPRequiereelconocimientodelasecuenciaparadiseñarGSPandGSP1【结果与分析】利用凝胶成像分析仪对电泳结

8、果进行拍照和结果记录；观察胶上是否有预扩增的主要产物带。对比目的基因产物的电泳谱带分子量和谱带的特异性，确定和描述谱带特征。RT-PCR扩增得到的810bp的目的基因产物的电泳结果实验中应注意的问题RNA提取过程中防止降解去除DNA的污染实验中注意设置阴性对照在冰上操作思考题