rt-pcr法检测myct-1基因在ges-1细胞中的表达

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1、RT-PCR法检测MYCT-1基因在GES-1细胞中的表达【摘要】目的检测MYCT-1(myctarget)基因在胃黏膜GES-1细胞系中的表达，探讨GES-1细胞作为RNA干涉细胞模型的价值。方法用TRIZOL法提取GES-1细胞总RNA，RT-PCR法扩增MYCT-1cDNA，DNA测序验证。结果在GES-1细胞中检测到504bpMYCT-1cDNA片段，测序证实与GenBank报道序列完全一致。结论GES-1细胞中存在MYCT-1表达，可作为RNA干涉细胞模型。【关键词】MYCT-1;GES-1细胞系;RT

2、-PCR　MYCT-1(myctarget1)是本室克隆的新候选抑癌基因，GenBank登录号NM_025107[1]，曾命名MTLC(myctargetfromlaryngealcancercells)。前期研究表明MYCT-1广泛表达于多种正常组织，且在胃癌、喉癌、肝癌、乳腺癌等多种恶性肿瘤组织中表达下调[2～5]。为进一步研究MYCT-1基因的生物学功能及在肿瘤发生、发展中的作用，准备用RNA干扰(RNAinterence,RNAi)技术沉默正常细胞中MYCT-1的表达，以了解MYCT-1低表达对正常细胞生

3、长特性、细胞增殖、细胞周期及细胞凋亡的影响。本文用RT-PCR法和DNA测序检测胃黏膜GES-1细胞中MYCT-1的表达，探讨GES-1细胞作为RNA干涉模型的价值。5　　1材料与方法　　1.1材料GES-1细胞(肿瘤研究所);TRIZOL试剂、1640培养基、胎牛血清(FBS)(Gibco公司);反转录酶、Taq酶(Promega公司);MYCT-1引物(大连宝生物公司)，序列为：正向引物：5'-ATGGATCCCTGCACTGGCTGATGAGTGTGTA-3';反向引物：5'-GTAAGCTTGAACAGT

4、GCCTTCACCCTCGAGGT-3';其他试剂均为国产分析纯。　　1.2细胞培养将1.5×105GES-1细胞接种至35mm培养皿中，加入含10%胎牛血清1640培养基，在5%CO2、37℃条件下培养，铺满后以0.25%胰酶消化传代，4h后细胞贴壁生长，24h后进入对数生长期。　　1.3总RNA提取取对数生长期GES-1细胞1×106加入1mlTRIZOL试剂，匀浆后室温静置5min，加0.2ml氯仿涡漩振荡15s，室温放置2～3min。4℃、12000rpm离心15min，将上清液移至另一新管，加入0.5m

5、l异丙醇混匀，室温放置10min，4℃、12000rpm离心10min，弃上清液，加75%乙醇(DEPC处理水配制)1ml，涡漩漂洗1次，4℃7500rpm离心5min，弃上清液，空气干燥15min，沉淀溶于0.01%DEPC-treatedwater，置55℃～60℃水浴中孵育10min，取少量用于RNA含量及纯度测定，其余分装后置-70℃冰箱保存。5　　1.4cDNA的合成用反转录试剂盒将总RNA反转录成cDNA第一链，反应体积10μl，反应体系中加入：总RNA2.0μg，Oligo(dT)15引物0.5μl

6、，25mmol/LMgCl22.0μl，10mmol/LdNTP1.0μl，10×buffer1.0μl，RNaseInhibitor0.25μl，AMV(25U/μl)0.6μl，ddH2O补足10.0μl，30℃孵育10min，42℃孵育30min,99℃5min终止反应，5℃5min灭活反转录酶。-20℃冻存备用。　　1.5PCR扩增反应反应体系如下：反转录产物1.0μl，25mmol/LMgCl20.5μl，10×buffer2.5μl，引物各0.25μl，Taq酶(5U/μl)0.3μl，ddH2O补足

7、25.0μl。PCR反应条件为：95℃预变性30s，然后按95℃30s、56℃30s、72℃30s进行35个循环，最后72℃延伸10min。1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。　　1.6DNA测序PCR产物由大连宝生物公司测序。　　2结果　　2.1RT-PCR结果PCR产物琼脂糖电泳结果为单一条带，大小约504bp，与预期相符(图1)。　　2.2DNA测序结果5经与GenBank比对，扩增产物序列与MYCT-1cDNA序列完全相符。　　3讨论　　MYCT-1基因主要分布于细胞核，可能与细胞信号转导有关。组织表达谱分析

8、发现MYCT-1在各种正常组织中均有表达，而在胃癌、喉癌、乳腺癌、肝癌等多种恶性肿瘤表达下调，说明它对维持细胞的正常功能是必需的，可能是一个新的抑癌基因。利用细胞模型研究其功能是常用的方法之一。　　图1PCR扩增产物电泳结果　　M：DL2000marker1：MYCT-1　　RNA干涉(RNAinterference,RNAi)是由双链RNA引发的转录后基因沉默现象，这一