半定量RT-PCR检测猪延髓中色氨酸羟化酶2基因表达方法的建立

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1、万方数据动物医学进展。2010，31(7)：1-6ProgressinVeterinaryMedicine半定量RT—PCR检测猪延髓中色氨酸羟化酶2基因表达方法的建立马红娜1，邓衔柏h，马勇江1，何敏2，习欠云3，宁章勇1，张桂红1，卢培成1，张曼玉1(1．华南农业大学兽医学院，广东广州510642，2．广东科贸职业学院。广东广州510430；3．华南农业大学动物科学学院，广东广州510642)摘要：利用半定量逆转录一聚合酶链反应(RT-PCR)技术，测定仔猪延髓组织中色氨酸羟化酶2(TPH一2)基因mRNA表达水平，以

2、p-actin为内标，分析相对表达量及其与驱赶应激的关系。通过探讨和优化PCR体系中退火温度、Mg'+浓度和循环次数等参数，建立了检测延髓组织中色氨酸羟化酶一2基因mRNA表达的半定量RT-PCR体系。通过分析色氨酸羟化酶一2PCR产物与p-actinPCR产物电泳后的灰度比值，可知驱赶应激对TPH-2基因mRNA表达量的影响。关键词：色氨酸羟化酶2；逆转录一聚合酶链反应；应激中图分类号：Q789；Q554．7文献标识码：A文章编号：1007—5038(2010)07-0001—06色氨酸羟化酶2(tryptophanhy

3、droxylase2，TPH一2)是色氨酸羟化酶的亚型之一，该基因优先在脑于中表达，负责合成中枢5一羟色胺(5-hydroxytr—YPtamine，5-HT)，代表神经性TPH基因[1]。TPH-2为中枢5-HT合成的限速酶，具有专一性，在组织中含量较低，且具有不稳定性。TPH-2基因单核苷酸多态性与精神疾病有某种程度的联系，目前国内外有TPH一2基因单核苷酸多态性与抑郁症及自杀行为研究的报道[2-5]，对色氨酸羟化酶的研究已经成为热点。应激是动物在生存过程中受到各种各样刺激后产生的非特异性适应性反应。适度应激可使机体度

4、过短期恶劣环境，适应能力得到提高，但强烈应激可影响多种生理活动和行为，长期应激会使机体神经内分泌失调，免疫力下降，引起胃肠道疾病，甚至不良精神变化。当体内受到心理、生理等刺激时可伴有脑内5一HT合成及代谢的改变。在一般研究TPH的试验中，都会有驱赶动物的可能。在猪的饲养管理过程中，常发生驱赶应激的现象。这种驱赶应激是否对延髓中的TPH-2有影响，所以本试验选择比运动性疲劳温和的驱赶应激来研究中枢TPH一2的变化。对于TPH一2的定性和定量，较常用的是免疫印迹、免疫细胞化学和免疫沉淀方法[6]。但这些方法难以及时、快速地检测

5、到机体内TPH一2的表达。鉴于此本试验拟采用RT．PCR技术对TPH一2进行半定量检测，建立半定量检测TPH一2的表达方法。1材料与方法1．1材料1．1．1试验用动物试验所用的仔猪延髓组织采自广州市增城区某猪场。分别选出相同日龄，体重相似的仔猪20头，随机分为两组，一组为驱赶应激组，一组为直接处死组，驱赶组驱赶应激后立刻处死5头，直接处死组直接处死5头。1．1．2试剂和仪器Trizol(Invitrogen)，EXTaqDNA聚合酶宝生物工程(大连)有限公司，TaqDNA聚合酶宝生物工程(大连)有限公司，DL2000Mak

6、er(TAKARA)，反转录试剂盒(MBI)，DEPC，溴化乙锭，琼脂糖等试剂。低温离心机，超净工作台，核酸分析仪，PCR仪，凝胶成像仪，电泳仪。1．2方法1．2．1延髓组织RNA的提取1．2．1．1裂解取约0．1g延髓组织放人研钵内，在液氮中将组织充分研磨成粉状后，倒人1．5mLEP管中，加入1mLTrizol溶液，充分振荡混匀。室温孵育10min，4℃12000r／min离心5min，弃沉淀。1．2．1．2分离按1mLTrizol加入200肛L氯仿的比例加入RNA专用氯仿，剧烈振荡15S，冰上静-收稿日期：2009-1

7、2-11基金项目：国家973计划项目(2009CBll8805)作者简介：马红娜(1982--)，女，河南周口人，硕士研究生，主要从事神经免疲内分泌调节研究。*通讯作者万方数据2动物医学进展2010年第31卷第7期(总第205期)置2min，4℃12000r／min离心15min。1．2．1．3沉淀取上清层到一个新1．5mLEP管中，加入500弘LRNA专用异丙醇，颠倒混匀，4℃孵育10min，4℃12000r／min离心10min。1．2．1．4洗涤弃上清，向管中加入lmL冰浴的750mL／L乙醇洗涤沉淀，4℃7500r

8、／min离心7min，弃去上清。1．2．1．5溶解RNA适度干燥后，用30弘L无RNA酶水溶解。用10g／L琼脂糖凝胶电泳检测其质量，核酸分析仪测量其浓度，以便在反转录的过程中进行定量。若暂时不用，可保存在--70℃中。1．2．2反转录用反转录试剂盒将总RNA反转录为eDNA，cDNA可直接用于PCR扩