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时间:2018-12-26
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1、为了适应公司新战略的发展,保障停车场安保新项目的正常、顺利开展,特制定安保从业人员的业务技能及个人素质的培训计划半定量rt-pcr试验心得 半定量PCR: 方法一: 一总RNA提取 1.将新鲜的悬浮培养细胞(25ml)倒进离心管中,8000g4℃离心10min,弃上清; 2.加液氮研磨一次,按108个细胞加1mltrizol,用枪反复吹吸至裂解液无明显沉淀,室温静置10min; 3.加200μl氯仿,剧烈震荡20s,室温放置5-10min; 4.取上层水相,一般取400μl足够; 5.加入等体积异丙醇,摇匀,室温放置10min; g离心10m
2、in; 7.75%乙醇1ml洗涤沉淀; g离心5min; 9.弃乙醇,短暂离心,吸干净残余乙醇,室温干燥3-5min; 10.用20μldepc水溶解沉淀; 11.电泳:110V,10-15min。(2%琼脂糖胶) 半定量PCR 二基因组DNA的去除目的-通过该培训员工可对保安行业有初步了解,并感受到安保行业的发展的巨大潜力,可提升其的专业水平,并确保其在这个行业的安全感。为了适应公司新战略的发展,保障停车场安保新项目的正常、顺利开展,特制定安保从业人员的业务技能及个人素质的培训计划 RNA样品中痕量的基因组DNA的去除方法参照DNaseI(R
3、NaseFree)试剂说明书进行。对除去基因组DNA的总RNA样品稀释后测定DD260nm和0D280nm,计算RNA的浓度。对初提及去除基因组DNA的总RNA样品各取5μl,2%琼脂糖凝胶,110v电压,l0min电泳后拍照。 三第一条链cDNA合成 ①冰上按以下次序配置体系 TotalRNAμg Primer(randomhexamerprimer)1μL Water,nuclease-free 合计12μL ②将体系轻柔混合短暂离心后,在PCR仪进行以下程序:65℃,5min后4℃,5min;③顺次加 5×Reactionbuffer4μ
4、L Rnaseinhibitor(20u/μL)1μL 10MmdNTPMix2μL ReverseTranscriptase(200u/μL)1μL ④将体系轻柔混合短暂离心,在PCR仪进行以下程序:25℃,5min;42℃,60min;70℃,5min。 四.内参基因和目的基因引物设计 内参基因需是看家基因,目的基因要求PCR产物在350-800bp之间,且退火温度和内参基因引物的退火温度保持一致。 五.内参基因和目的基因退火温度的确定目的-通过该培训员工可对保安行业有初步了解,并感受到安保行业的发展的巨大潜力,可提升其的专业水平,并确保其在
5、这个行业的安全感。为了适应公司新战略的发展,保障停车场安保新项目的正常、顺利开展,特制定安保从业人员的业务技能及个人素质的培训计划 进行不同的变性温度梯度PCR,内参基因和目的基因分管做,PCR结束后进行琼脂糖凝胶电泳 六.PCR循环数的确定 按普通PCR循环,设定为34个循环,内参基因和目的和目的基因分管作,内参 和目的基因都做6管,在PCR的第18、20、22、24、36、28、30、32、34个循环各拿出1管,一起跑电泳。选择循环次数在线性范围内,且电泳效果好的次数作为最佳循环次数。 七.半定量PCR 采用以上优化好的RT-PCR条件进行PC
6、R 上面的是提RNA的方法是提细菌的总RNA,酵母菌也适用,提真核细胞的总RNA还可以用酸性酚法提,效果很不错 方法二:目的-通过该培训员工可对保安行业有初步了解,并感受到安保行业的发展的巨大潜力,可提升其的专业水平,并确保其在这个行业的安全感。为了适应公司新战略的发展,保障停车场安保新项目的正常、顺利开展,特制定安保从业人员的业务技能及个人素质的培训计划 半定量反转录-聚合酶链反应是近年来常用的一种简捷、特异的定量RNA测定方法,通过mRNA反转录成cDNA,再进行PCR扩增,并测定PCR产物的数量,可以推测样品中特异mRNA的相对数量。以半定量RT-
7、PCR为基础建立起来的mRNA含量测定技术,较含内标化的RT-PCR定量测定的mRNA的方法更为简便可行。这种方法不另设‘内标准',排除了2对不同引物之间的相互抑制和灵敏读差异,而且具有明显的剂量-效益关系和良好的重复性。步骤。1、抽提RNA,2、反转录获得cDNA,3、以cDNA为模板做PCR。 注意: 1、RNA制备:一般制备总RNA即可,有时需要制备mRNA,初学者还是选择Trizol,大量制备采用传统的方法自己配,实际上和trozol一样的,有时效果还好,trizaol的优点在于质量保证,使用方便,效率高,根据不同组织用trizol一般可以提到全部
8、RNA的50%以上,有些可以到达80%
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