猪乙脑RT-PCR快速诊断方法的建立

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1、猪乙脑RT-PCR快速诊断方法的建立冯永胜江科衣服徳青岛市畜牧兽医研究所(266100)摘要：根据猪乙脑病毒SA14-14-2毒株的慕因组序列，采用Primer5.0引物设计软件，设计1对乙脑病毒特异性引物，建立了检测猪乙脑病毒的的RT-PCR方法，利用合成的引物对乙型脑炎病毒(JEV)、猪瘟病毒(CSFV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)进行RT-PCR扩增，结果仅JEV能扩增出819bp大小的特界性片段，证实了建立的RT-PCR对乙型脑炎病毒具有较高的特异性。灵敏试验表明，检测JEV的RT-PCR的最小灵敏度能够达到纳克(ng)级别。该方法的建立，对于准确快速检

2、测JEV提供了依据。流行性乙型脑炎，简称乙脑，是由FI木乙型脑炎病毒(JapaneseencephalitisVirus,JEV)引起，是典型的人畜共患病之一。猪是JEV最重要的口然宿主，可引起母猪流产、公猪睾丸急性炎症或不育等。病毒通常在蚊一猪一蚊等动物间循环，JEV在猪群的长时间贮存与循环传播可促进JEV的变异，增加环境中JEV的浓度，而使人感染JEV的儿率升高。其他动物包括人在内，大都呈现隐性感染，病毒血症期短。近几十年，许多学者从流产的死胎、公猪睾丸及蚊虫体内分离到该病毒。因此，研究猪源JEV的流行病学，建立JEV快速诊断技术，对养猪业与公共卫生均具有重要意义。1

3、.材料与方法1.1引物设计参照乙脑病毒SA14-14-2毒株的基因组序列，采用Primer5.0引物设计软件，设计1对乙脑病毒特异性引物，引物序列为：P1：5,-ATCCTGGCTATGCTTTCCT-37,P2:5，-CTCTGTTTCTCCACGCTGT-37,扩增产物的长度为819bpo1.2乙脑病毒RNA提取取250ul经反复冻融的乙脑病毒细胞培养液，加750ulTrizol裂解液，充分震荡,静置5min后加200ul氯仿,彻底混匀,4°C,lOOOOrpm15min,取上清。加入等体积的异丙醇，混匀,—20°C,30min或15min后,12000rpm,10m

4、ino倒掉上清,5175%的DEPC乙醇洗涤沉淀,4°C,12000rpm5min,其上清，凉干。加入lOulDEPC水溶解,-80°C保存备用。1.3RT-PCR特异性检验使用相同的引物在相同条件下扩增乙型脑炎病毒（JEV）、猪瘟病毒（CSFV）和猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）,以检验建立的RT-PCR的特异性。按照人连宝生物（TaKaRa公司）RT-PCR试剂盒操作说明，RT-PCR反应条件：50°C反转录30min,94°C预变性2min,94°C变性30s,53°C退火30s,72°C延伸1min,30个循环,72°C延伸10min。PCR结束后，扩增的特异

5、性片段经1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定。1.4RT-PCR灵敏性检验将培养的乙脑病毒培养液作依次作101010=10"、107稀释，高速离心后取上清，提取RNA进行RT-PCR,电泳检查结果。1.1.5RT-PCR临床应用建立猪流行性乙型脑炎病毒的RT-PCR检测技术后，从临床上采集67份病猪疑似样品（心、肝、肺、淋巴结和脑组织）和53份蚊虫样品，进行RT-PCR扩增，检测猪流行性乙型脑炎病毒。2.结果2.1RT-PCR特异性检验利用合成的引物对乙型脑炎病毒(JEV)、猪瘟病毒(CSFV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)进行RT-PCR扩增,结果仅JEV能扩增出81

6、9bp大小的特异性片段,其它两种病毒未扩增岀片段(图1),证实了建立的RT-PCR对乙型脑炎病毒具有犊高的特异性。2000bp1000bp500bp250bp图1乙型脑炎病毒RT-PCR特异性测定(M为DNAMarkerDL/2000,1为JEV,2为CSFV,3为PRRSV)2.2RT-PCR灵敏性检验将病毒培养液作依次作10110"、1010107稀释，然后进行RT-PCR扩增。结果显示,10_1(T和10"稀释浓度RT-PCR扩增结果均为阳性，但DNA条带亮度逐渐降低，10"稀释度RT-PCR扩增结果为阴性。根据cDNA模板的原始浓度推算，检测JEV的RT-P

7、CR的最小灵敏度能够达到纳克(ng)级别。2.3RT-PCR临床应用效果运用建立的RT-PCR检测技术，从67份临床病猪样品屮检测出8份乙脑病毒阳性样品，阳性率为11.9%；从53份猪场周围收集的蚊虫样品屮检测出2份乙脑病毒阳性样品，阳性率为3.8%o建立猪乙型脑炎病毒快速诊断技术通过进行RT-PCR特异性检验、RT-PCR灵敏性检验和RT-PCR临床应用等工作，证明对乙型脑炎病毒具有较高的特异性，根据cDNA模板的原始浓度推算，检测JEV的RT-PCR的最小灵敏度能够达到纳克(ng)级别。临床应用效果良好。1.结论建立猪流行