sty及spa的rt-pcr检测方法的建立

《sty及spa的rt-pcr检测方法的建立》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、单位代码：10222学号：10813037分类号：佳木斯大学硕士学位论文论文题目：STY及SPA的RT-PCR检测方法的建立研究生姓名：肖燕学科、专业：流行病与卫生统计学导师姓名、职称：祝丽玲教授论文答辩日期：2013年6月8日佳木斯大学硕士学位论文佳木斯大学硕士学位论文论文题目：STY及SPA的RT-PCR检测方法的建立研究生：肖燕专业：流行病与卫生统计学指导教师：祝丽玲单位：佳木斯大学公共卫生学院协助指导教师：李明春单位：佳木斯市疾控中心马淑英单位：佳木斯市疾控中心学习期限：2010年9月至2013年6月学位授予单位：佳木斯大学I佳木斯大学硕士学位论文学术诚信承诺本人郑重声明：所

2、呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，也不包含为获得佳木斯大学或其他教育机构的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中做了明确的说明并表示了谢意。签名：___________日期：____________关于论文使用授权的说明本人完全了解佳木斯大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。（保密的论文在解密后应遵循此规

3、定）签名：___________导师签名：___________日期：____________II佳木斯大学硕士学位论文目录一、中文摘要Ⅳ二、英文摘要Ⅵ三、前言1四、文献综述5五、STYSYBRGreenRT-qPCR体系的建立14六、STY及SPA双重TaqManRT-PCR体系的建立23七、讨论36八、结论39九、参考文献40十、致谢41十一、英文缩写42十二、攻读学位期间发表的论文42十三、附图43III佳木斯大学硕士学位论文摘要【目的】建立伤寒及甲型副伤寒沙门菌的实时荧光定量PCR检测法，具体包括：（1）伤寒沙门氏菌SYBRGreen实时荧光定量PCR检测方法。（2）伤寒及甲

4、型副伤寒沙门菌TaqMan实时荧光定量PCR检测方法。评价以上方法的特异性、敏感性、检测下限、以了解人群中对该菌的携带情况提高感染人群中伤寒及甲型副沙门氏菌的检出率。【方法】对建立伤寒及甲型副伤寒沙门菌的实时荧光定量PCR检测法，本研究采取以下实验方案：（1）经查阅资料后确定待测目的基因，并通过序列比对确定待检测基因的保守序列STY1633（SalmonellaTyphi）及SPA4289（SalmonellaentericaserovarsparatyphiA），然后借助探针设计软件BeaconDesigner7.7设计单重及双重实时荧光定量PCR引物和探针。（2）分别在1-10n

5、mol/L10个浓度梯度和2-10nmol/L5个浓度梯度内，在美国Bio-Rad公司的CFX96荧光定量PCR仪上进行扩增比较，优化引物和探针浓度。（3）SYBRGreen实时荧光定量PCR灵敏度、特异度的评价。（4）SYBRGreen法检测粪便模拟标本中的伤寒沙门菌，评价其敏感性、特异度、检测下限、菌液增菌前后的检测下限。（5）单重TaqMan实时荧光定量PCR检测方法灵敏度、特异度的评价。（6）将优化了的单重实时PCR反应体系组合成双重TaqMan实时PCR反应体系，并评价其检测下限。【结果】（1）利用SYBRGreen法检测粪便模拟标本中的伤寒沙门菌纯菌及10份伤寒患者标本均

6、扩增阳性，其余的非伤寒沙门菌、致腹泻的其他5种肠道致病菌及引起发热症状的8种常见非肠道病原菌纯菌及相应患者标本均扩增阴性。在对纯伤寒沙门菌DNA检IV佳木斯大学硕士学位论文测中，实时荧光定量聚合酶链反应法的检测下限为500fg/反应，即97个拷贝/反应。以4粪便模拟样品提取DNA为模板的检测中，增菌前检测下限达10cfu/g，增菌后可达50cfu/g。（2）在单重TaqMan实时荧光定量PCR法检测伤寒沙门菌的反应体系中，优化后的反应体系灵敏度和特异度均为100％。检测伤寒沙门菌纯菌DNA的检测下限为100fg/反应，即19.4个拷贝/反应,扩增效率为90%。以伤寒粪便模拟样品提取D

7、NA为模板的检测中，增菌前检测下限即可达1cfu/g。单重TaqMan实时荧光定量PCR法检测甲型副伤寒沙门菌纯菌DNA的检测下限2.5pg/反应，即485个拷贝/反应，扩增效率为90%。以甲型副伤寒粪便模拟样品提取DNA为模板的检测中，增菌前达未检出，但增菌后检测下限可达10cfu/g。（3）经优化的伤寒和甲型副伤寒双重TaqMan实时荧光定量PCR反应体系中，对两种纯菌DNA的检测下限为分别为1pg/反应和2.5pg/反应，即194个拷贝/反应和485