猪鼻支原体PCR检测方法的建立-论文.pdf

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1、2014第1期养猪SWINEPRODUCTION1l3猪鼻支原体PCR检测方法的建立沈强，李守刚，毛紫微，卫秀余(上海市奉贤区动物疫病预防控制中心，上海奉贤201400)中图分类号：$858．28文献标志码：A文章编号：1002—1957(2014)01一O113—02摘要：猪鼻支原体是猪鼻腔上的常在菌，引起仔猪多发性浆膜炎和关节炎，是猪场一种重要的消耗性疾病。为了对猪场中猪鼻支原体的感染和发病情况进行初步调查，建立一种可靠的PCR检测体系。方法的敏感性需满足检测要求，能与几种常见的导致猪呼吸道和多发性浆膜炎的疾病区分开。关键词：猪鼻支原体；PCR；猪多发性浆膜炎猪鼻支原

2、体~ycoplasmahyorhinis，Mhr)是猪地中加入600LLL清洗液，10000r／s离心30S，清洗重复方性肺炎的病原之一，引起仔猪多发性浆膜炎和关1次，第2次洗完后10000r／s离心30s甩干。吸附柱节炎，混感其他呼吸系统疾病时死亡率上升11]，此外，取出放入新的EP管，向吸附柱中加入20uLDNA洗该病会污染培养的动物细胞组织回。目前猪鼻支原体脱液。模板可直接使用，保存可置于一20℃同。的感染情况调查已引起学者的重视，国内王贵平Il、马1．5目的基因PCR反应体系华崇12]、甘一迪等圆，国外CaronJ等使用PCR方法进PCRbuffer14L，Taq

3、酶Mix1L，上下游引物P1、行猪鼻支原体检测，进行疾病监测。本试验于2012P2各1．5txL(浓度5Ixmol／L)，模板2L，总倒只20L。年9__12月在上海市奉贤区动物疫病预防控制中心1．6目的基因PCR反应程序进行，通过建立猪鼻支原体PCR检测方法，与猪肺炎95℃5min；94℃30S、50℃30s、72qC30S，支原体、副猪嗜血杆菌、猪胸膜肺炎放线杆菌、猪圆35个循环；72℃10min。调整引物和模板浓度确定环病毒2型及伪狂犬病病毒进行区别诊断，为进一最佳反应体系和反应程序。步调查猪场感染情况及生物制品污染情况奠定基础。1．7目的基因电泳观察1材料和方法制

4、备1％琼脂糖凝胶(EB染色)，TAE做电泳缓1．1菌株冲液。向反应管中各加入5IxLloadingbuffer混合，每猪鼻支原体培养物、猪肺炎支原体、副猪嗜血个加样孔加4L混合液，加4L的DL2000Marker。杆菌、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌阳性菌种由江苏110V电压，400mA电流电泳35min，用凝胶成像农科院邵国清博士惠赠，猪圆环病毒2型、伪狂犬病系统观察并拍照记录。病毒疫苗由奉贤兽医研究所提供。1．8方法敏感性1．2试剂为检验此方法敏感性，提取的DNA做10倍梯DNA提取试剂盒、PCR预混液、Taq酶购白北度稀释后作为模板71。京天恩泽有限公司，PBS自制。1．

5、9方法特异性1．3引物为检验此PCR体系的特异性，检测猪肺炎支原根据Mhr基因序列设计了一对引物P1：5一体、副猪嗜血杆菌、猪传染性胸膜肺炎阳性菌种、猪GTAGTCAAGCAAGAGGATGT一3，P2：5一GCTGGAG圆环病毒2型、猪伪狂犬病病毒阳性共5个样品。1TrA1TrATAccAGGA一3。目的片段大小346bp，引物2结果与讨论由上海生工生物工程技术有限公司合成。2．1方法有效性及敏感性1．4模板8号中模板浓度为0．5ng／mL，结果显示阳性，敏取100IxL猪鼻支原体培养物加入1．5mLEP管感度满足检测需求(图1)。中，加入200IxL消化液和20L蛋白

6、酶K，56℃水浴60min。冷却后加入300IxL结合液，混匀后加入吸附柱，10000r／s离心30s。弃去收集管中液体，向吸附柱500bp250bp346bp收稿日期：2013—12—26作者简介：沈强(1966一)男，上海人，研究员，硕士，研究方向为动物疫苗研发．E—mail：shenqiang66@citz．net1为DL2000Marker，2为阴性，3为阳性，4～8为浓度分别为5000、通讯作者：卫秀余(1962一)，男，上海人，高级兽医师，硕士，主要从事500、50、5、0．5nmL的稀释阳性样品。猪病临床和实验室诊断工作．E—mail：weixiuyu1@1

7、63．com图1方法敏感性电泳114养猪SWINEPRODUCTION(1)20l4猪场采集样品和疫苗样品中猪鼻支原体的检测李守刚，毛紫微，石慧花，卫秀余(上海市奉贤区动物疫病预防控制中心，上海奉贤201400)中图分类号：$858．28文献标志码：A文章编号：1002—1957(2014)01一O114一O2摘要：猪鼻支原体(Mycoplasmahyorhinis，Mhr)是引发猪地方性肺炎及仔猪多发性浆膜炎、关节炎的重要病原之一，也会引起猪场的常见消耗性疾病。Mhr常常污染细胞培养物，对疫苗生产造成巨大危害。定期对猪场常用