支原体检测PCR方法.doc

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1、PCR法检测支原体实验原理：通过对支原体特定的序列设计引物，当存在支原体污染时通过PCR特异性扩增，会将目标DNA特异性的复制，然后通过琼脂糖电泳观检测，会跑出条带出现阳性结果。反之当没有支原体污染时，由于没有模板，PCR无法扩增，则琼脂糖电泳跑不出条带，出现阴性结果，为确保PCR法的精确性，故需要找到最优的PCR条件在进行检测。实验目的：检测培养的细胞是否有支原体污染。实验材料：0.5mlEP管；PCR管；镊子；手套；口罩；EP管架；移液枪（100ul，10ul）及配套枪头(黄、白)；ddH2O；上下

2、游引物（两组）；dNTPs；10xBuffer；EasyTaq；冰盒；琼脂糖；锥形瓶（200ml）；量筒（50ml）；全套琼脂糖电泳设备（电泳槽，制胶槽，梳子，电源输出）；凝胶成像系统；PCR引物：LZY-5MycouniversalF：GGGGAATGGGTGAGTAACACGLZY-5MycouniversalR：CGGATAACGCTTGCGACCTATG产物大小：500bpLZY-6mycotestF：GGGAGCAAACAGGATTAGTATCCCTLZY-6mycotestR：TGCACCA

3、TCTGTCACTCTGTTAACCTC产物大小：250bp实验步骤：1、取样：直接取培养细胞的培养基上清。2、PCR（为25ul体系）1、配制反应体系，根据检测样本数+1个阴性对照（水）+1个阳性对照，算出PCR样本的个数，在此基础上增加几管的量，把除检测培养基外的其他组分按计算好的量加到一起，混匀后分装，最后加入检测培养基。25ul反应体系5#引物：LZY-5Mycouniversal反应体系反应条件检测培养基1ul94℃3minLZY-5-F0.5ul94℃30sLZY-5-R0.5ul55℃30

4、s10xBuffer2.5ul72℃30sdNTP0.5ul25cycles或30cyclesEasyTaq0.5ul72℃10minddH2O19.5ul6#引物：LZY-6mycotest反应体系反应条件培养基1ul94℃3minLZY-5-F0.5ul94℃30sLZY-5-R0.5ul51℃30s10xBuffer2.5ul72℃20sdNTP0.5ul35cyclesEasyTaq0.5ul72℃5minddH2O19.5ul3.琼脂糖凝胶的制备1%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果。上图为两对引

5、物梯度PCR的结果，5#引物选择：55℃（55.9℃），6#引物引物选择：51℃