支原体PCR检测步骤.doc

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1、支原体PCR检测步骤一、提取支原体DNA1，取1ml细胞培养液，（对照为1ml新鲜培养液）13000g离心5min，用1mlD-PBSA（即无钙离子、镁离子的PBS）重悬，离心再重悬，重复两次。2，沉淀加0.2mlD-PBSA重悬，90℃，15min。3，抽提DNA：氯仿，异丙醇抽提法二、pcr体系：灭菌水：6ulFprimer：0.5ulRprimer：0.5ulcDNA1uldNTPMIXa0A

2、：0.8ulbuffer:1ul放在PCR仪中：进行下列步骤：95℃7min、72℃3min、65℃2min、72℃5min打开热盖，美管中加入0.2ultaq酶继续下面步骤：（95℃4s、65℃8s、72℃16s）每次外延1s32个循环，最后延伸72℃10min附支原体16s引物：（已blast过）（1）.正向引物：5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAGTA-3’（2）.反向引物：5’-TGC

3、ACCATCTGTCACTCTGTTAACCTC-3’产物大小：705bp