提取RNA到PCR检测全部实验步骤.doc

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1、提取RNA（以下步骤都在冰盒中进行）1.TRLzol加入培养皿中（1ml），静置5min后，将每个面都吹一下，转入1.5ml的离心管（附一）2.加入氯仿，量为TRLZOL的五分之一，悬空打入，然后摇匀静置5min，然后离心：4℃，12000g，15min3.吸取三层中最上层的水层，加入等量的异丙醇，悬空打入，混匀，静置10min，离心:4℃，12000g，10min，吸去上清液4.加入1ml的75％的乙醇，离心：4℃，12000g，5min（重复两遍）5.吸干酒精，静置10min使酒精风干，再加入20μl的DEPC水，加

2、入后吹打几下，使RNA溶解。6.用DEPC水稀释10-20倍，每份总量为10μl，既9μl的水和1μl的RNA，测RNA浓度（附二）7.逆转录，总体系10μl，RNA加入量不超过500ng，但是尽量靠近500ng。5×Prime2μlRTEnzyme0.5μl10μlPrimer0.5μlRandom0.5μl6.5μlRNADEPC水8.先配好前四样的混合液，后两样根据测的RNA浓度计算，保证RNA不超过500ng9.按照要求加入药品，放入仪器中，设置HAO，10μl逆转录。10.转录完成后，取1μl的样品，稀释10倍

3、，用Q5000测浓度，一般都是120-130，所以可以稀释13倍，使cDNA不超过100ng。算好总量，提前混合11.PCR体系：SYBRGREEN12.5μl使用前离心，再根据说明书溶解成母液，再稀释10倍成为工作液DEPC水10.5μl前引物0.5μl后引物0.5μlDNA模版1μl1.前后引物和模版稀释后都需要涡旋离心。加入SYBRGREEN需要避光，准备八连管。2.PCR仪器使用前先打开预热30min，打开GFXmanager软件，File里打开Protocol，选择设定好的程序，再点next，设定plate，s

4、etting里的Target（目标名称）和Sample（样品名称）UNK目标引物名称样品名称3.选择样品位置，名称，直到显示点击开始运行。附一：台内操作手套在细胞间拿，所有物品进入都需酒精灭菌，离心管需用镊子夹出使用，出操作台要带上一层一次性的手套防止污染。附二：测浓度需要用一组空白的溶剂进行BLANK，确定基线。，每份样品涡旋离心使其浓度均匀。使用Q5000进行测量BLANK空白校准Measure测样品浓度Sampletype测量种类260/280纯度，2.0左右，不低于1.8260/230有机残留，2.0左右每次用完

5、都用二次水湿润的纸擦一次，干燥的纸擦一次，每个样品测三次。导出到Excel。退出系统exit关闭机器，罩上罩子。