rna提取_rt-pcr技术专题

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1、TIANGENBIOTECH(BEIJING)CO.,LTD―核酸纯化系统“从RNA提取到荧光定量PCR”解决方案市场部蒋彦波2008年4月武汉RNA相关知识及提取原理RNA提取流程特殊组织RNA的提取RNA的评价、鉴定与保护TIANGEN公司RNA提取产品选择指南AAAAAA细胞中RNA的种类和含量AAAAAAtRNAmRNArRNARNase不同丰度组织名称样品量总RNA含量高丰度肝脏1mg2-4μg脾脏1mg心脏1mg中丰度大脑1mg0.05-2μg胚胎1mg肾脏1mg肺1mg低丰度膀胱1mg0-0.05μg骨1mg脂肪1mg高丰度成纤细胞1050.5-1μg人白细胞105中丰

2、度酵母1050.5-1.5μg拟南芥叶片1mg0.2-0.5μg低丰度烟草叶片1mg0.05-0.1μg玉米叶片1mgRNA提取的基本方法——裂解原理不同异硫氰酸胍/苯酚法细胞在变性剂异硫氰酸胍的作用下被裂解，同时核蛋白体上的蛋白变性，核酸释放释放出来的DNA和RNA由于在特定pH下溶解度的不同而分别位于整个体系中的中间相和水相，从而得以分离胍盐/β-巯基乙醇法盐酸胍裂解样本，抑制RNase的活性β-巯基乙醇变性蛋白吸附材料纯化原理硅基质高盐低pH值结合核酸低盐高pH值洗脱阴离子交换树脂低盐高pH值结合核酸高盐低pH值洗脱磁珠磁性微粒挂上不同基团可吸附并携带RNA沉淀法介质吸附RNA

3、提取的基本方法——吸附方法不同RNA相关知识及提取方法原理RNA提取流程特殊组织RNA的提取RNA的评价、鉴定与保护TIANGEN公司RNA提取产品选择指南样品前处理——实验材料的选择选择新鲜血液，不得超过4小时选择新鲜的幼嫩组织选择处于生长旺盛的时期收集细胞选择新鲜、生长旺盛的组织可将新鲜血液先进行红细胞裂解，得到白细胞，然后加入一定量的TRNzol，-70℃保存较长时间去掉培养基，加入一定量TRNzol-70℃保存较长时间推荐使用专门的RNA样品储存液进行储存液氮保存，避免反复冻融样品前处理——实验材料的保存液氮研磨匀浆或液氮研磨应用红细胞裂解液处理直接裂解或胰蛋白酶处理样品前处

4、理——处理方式Q-1：样品量是否越多越好？A-1：不是。在试剂盒规定内增加，若过度增加样品处理量会影响RNA得率；如增加样品起始量，则后续实验中各溶液量均要相应按比例增加。处理样品量RNA得率实际得率预期得率最大量样品前处理——常见问答Q-2：如何保证研磨过程和匀浆中RNA不被降解？A-2：研磨过程要迅速，同时尽量避免外源RNA酶污染；匀浆过程中一定要保证组织和裂解液充分接触，尽量在匀浆前将组织低温切割成小块加入裂解液中，可确保RNA不被降解。样品前处理——常见问答细胞裂解－－释放RNA异硫氰酸胍/酚－TRNzol、TRNzol－A＋总RNA提取试剂独特配方--RNAplant植物R

5、NA提取试剂胍盐/β-巯基乙醇—RNApreppure系列RNA提取试剂盒RNA纯化与获得－－纯化要求RNA纯化要求1纯化后不应存在对酶(如逆转录酶)有抑制作用物质2蛋白质、多糖和脂类分子等的污染降低到最低程度3排除DNA分子的污染使用试剂（以TRNzol－A＋为例）使用试剂盒（以RNApreppure试剂盒为例）实验举例及注意事项操作流程样品前处理、细胞裂解试剂试剂盒抽提沉淀加入吸附柱洗涤溶解RNA沉淀获得RNA产物加去蛋白液和DNaseI漂洗RNA洗脱收集样品处理量与加入的TRNzol-A+的量要对应1mlTRNzol-A+对应：血液0.3ml动植物组织30-50mg贴壁细胞：每

6、10cm2培养面积悬浮细胞：5-10×106细胞TRNzol-A＋试剂法提取——加量细胞基因组DNA水相有机相RNA氯仿纯化pH5.7离心加入裂解液(TRNzol-A+)细胞选择贴壁细胞悬浮细胞TRNzol-A＋试剂法提取——提取动物培养细胞等体积异丙醇沉淀75％乙醇洗涤沉淀晾干溶解RNA吸附柱去蛋白液漂洗洗脱水相RNA传统方法：有机溶剂抽提，得率高柱纯化法：纯度高TRNzol-A＋试剂法提取——提取动物培养细胞图片说明：M:TIANGENMarkerIIIA:A公司同类产品提取动物细胞结果T:TIANGEN公司TRNzol-A＋提取动物细胞结果试验材料：Helacell/106实验

7、方法：TIANGEN公司TRNzol-A+A公司同类产品试验结果：得率：TRNzol-A+得率与A公司同类产品略高纯度：经TRNzol-A+纯度较高，无明显DNA、蛋白残留MTA123456TRNzol-A＋试剂法提取——实验举例前处理裂解沉淀洗涤抽提溶解RNA降解处理样品量上清吸取，杂质去除适量异丙醇乙醇，盐离子残留RNA不宜太干TRNzol-A＋试剂法提取——注意事项操作流程样品前处理、细胞裂解试剂试剂盒抽提沉淀加入吸附柱洗涤溶解RNA沉淀获得RNA产