总RNA的提取及RT-PCR

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1、RT-PCR技术一、真核生物基因的表达真核生物的基因含有大量的非编码区，称为内含子（intron），真正编码蛋白的区段是被内含子隔开的，这些编码区叫做外显子（exon）。真核生物的DNA转录成为RNA之后，经过剪切和拼接，去掉这些非编码区，才形成成熟的mRNA，由mRNA再翻译成蛋白质。基因mRNA蛋白质多肽链真核生物基因的表达转录翻译外显子内含子二、RT-PCR技术的应用RT-PCR是一种将cDNA合成与PCR技术结合分析基因表达的快速灵敏的方法，主要用于：检测mRNA表达信息,进行基因表达差异分析等研究克隆cDNA构建cDNA文库实验一Trizol法提取细胞总RN

2、A（一步法）真核细胞总RNA主要由rRNA（80-85%）、tRNA和核内小分子RNA(10-15%)、mRNA（1-5%）组成，其中rRNA、tRNA和mRNA位于细胞质中。大多数真核细胞mRNA在其3'端均有一多聚A(PolyA)尾巴。真核细胞RNA的种类RNA实验失败的主要原因是RNA酶的污染。由于RNA酶广泛存在而稳定，可耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、高压灭菌等，只要存在少量的RNA酶就会引起RNA的降解，而所制备的RNA的纯度和完整性又可直接影响RNA分析的结果，所以建立一个无RNA酶的环境对于制备RNA很重要。实验前的准备常用的RNA酶抑制剂：焦磷酸二乙

3、酯（DEPC）：与RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合，有高致癌性。（实验准备阶段使用）异硫氰酸胍、氯仿：提取RNA同时也使RNA酶失活。RNA酶的蛋白抑制剂（RNasin）：从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。（合成cDNA阶段使用）1.在实验室最好有专门的RNA操作区，离心机、移液器、试剂等专用。RNA操作区应保持清洁，并定期进行除菌。2.相关耗材(Ep管、Tip头)应先用0.1%DEPC水浸泡过夜并高压消毒。也可直接使用厂家供应的无RNase的Ep管、Tip头。3.金属器械和玻璃器皿应在使用前于180℃的高温下干烤6hr或更长时间。4.塑料器皿可用0.1%D

4、EPC水浸泡或用氯仿冲洗5.配制的溶液应尽可能加入DEPC至终浓度0.1%处理12hr以上，然后用高压灭菌除去残留的DEPC。（不能用DEPC或高压灭菌的试剂，如Tris、DTT等，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经0.22μm滤膜过滤除菌）6.人的唾液和汗液含有RNA酶，故在操作中应戴手套，避免讲话。7.一些组织如脾脏比其它组织含有更多的RNA酶；细菌比哺乳动物细胞含有更多的RNA酶。因此从这些样本中制备RNA应采取更严格的预防措施。Trizol是一种苯酚与异硫氰酸胍(GTC)的混合物，异硫氰酸胍可裂解细胞，促使核蛋白体的解离，使RNA与蛋白质分离。加入氯

5、仿可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚促使RNA进入水相，离心后，RNA保留在水相中，DNA和蛋白质保留在有机相中。转移水相，加入异丙醇沉淀RNA，从而得到纯化的总RNA。实验原理准备试剂：Trizol,氯仿，异丙醇，DEPC水，70℅乙醇(需用DEPC水配制)Trizol的用量：组织lml／50－100mg;细胞lml／10cm2培养瓶面积或106个细胞操作步骤取材:用生理盐水漱口后，含生理盐水约2~3min，用15ml离心管（4000rpm5min）收集细胞(同管多次离心)，弃上清沉淀中加入1mlTRIzol，旋涡震荡10s重悬沉淀，加样枪打匀溶液后转移至1.5mlEP管

6、，15~30℃放置5min加入0.2ml氯仿，用手摇晃15s，15~30℃放置5min12000rpm离心15min小心吸取上清，转移至新的1.5mlEp管，加入等体积的异丙醇，15~30℃放置10min12000rpm离心15min，小心去上清，加入1ml70%乙醇，震荡数秒，8000rpm离心5min小心去上清，室温干燥5min，加入10ulDEPC水，打匀55℃水浴10分钟助溶RNA保存：溶解在无RNAase的水或TE中，在-70℃或更低温度中保存时间在一年以内，但避免反复冻融，应分装保存。从富含RNase的样品（如胰脏、肝脏）中分离到的RNA需溶解在去离子甲酰

7、胺中存于-70℃，至少可以保存一年。需使用RNA时，可以加入NaAc至终浓度0.3M，12000×g离心5分钟，70%乙醇洗涤后再用无RNAase的水或TE溶解。RNA提取结果的鉴定：紫外分光光度法测定260/280nm比值大约为2.0，如果比值过低，表明有蛋白质或酚污染。RNA浓度(μg/ml)=OD260×稀释度×40。RNA电泳鉴定通过甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA是否有降解电泳检测结果有三条清晰的rRNA带：28S，18S和5S（普通的1%琼脂糖凝胶电泳也可用于鉴定，电泳槽用去污剂处理，水冲干净，用新鲜的电泳缓冲液）TotalRNA实验二