总RNA提取定量与RT-PCR

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1、总RNA的提取、定量与RT-PCR南方医科大学生物化学与分子生物学实验教学示范中心ExpertimentalTeachingCenterofBiochemistryandMolecularBiology完整RNA的提取和纯化,是进行RNA方面的研究工作如Nothern杂交、mRNA分离、RT-PCR、定量PCR、cDNA合成及体外翻译等的前提。掌握从细胞中提取总RNA的方法熟悉紫外吸收法检测RNA浓度与纯度的原理及测定方法掌握RT-PCR基因扩增的原理和过程目的实验流程提取原理操作步骤逆转录原理操作步骤提取总RNA定量合成cDNA第一链原理体系引物选择PCR电泳原理电泳步骤电泳计算

2、方法操作步骤第一部分细胞总RNA的提取及定量ExtractionandQuantitationofCellTotalRNA所有RNA的提取过程中都有五个关键点：样品细胞或组织的有效破碎；有效地使核蛋白复合体变性；对内源RNA酶的有效抑制；有效地将RNA从DNA和蛋白混合物中分离；对于多糖含量高的样品还牵涉到多糖杂质的有效除去。关键点原理10-5μgRNA/细胞RNA分离的方法：异硫氰酸胍氯化铯超速离心法；盐酸胍-有机溶剂法；氯化锂-尿素法；蛋白酶K-细胞质RNA提取法；异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法(Trizol法)等。目前常用的是Trizol法。rRNA80-85%：28S18S5S

3、tRNA,snRNA10-15%mRNA1-5%原理Trizol是一种新型总RNA抽提试剂其主要成分是异硫氰酸胍和酚。异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质，其主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白/核酸物质解聚得到释放。酚虽可有效的变性蛋白质，但是它不能完全抑制RNA酶活性，因此Trizol中还加入了8-羟基喹啉、β-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase。在加入氯仿离心后，氯仿比重大，使溶液分为水相、中间层和有机相。RNA在上层水相中，DNA和蛋白质位于中间层，有颜色的下层为有机相。取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA；用乙醇沉淀中间层可回收DNA。原理RNA酶污染

4、来源RNA酶可耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、高压灭菌等。严格控制外源性RNA酶的污染：外源性的RNA酶存在于操作人员的手汗、唾液等，也可存在于灰尘中，造成器械、玻璃制品、塑料制品、电泳槽、研究人员的手及各种试剂的污染。最大限度地抑制内源性的RNA酶：而各种组织和细胞中则含有大量内源性的RNA酶。常用的RNA酶抑制剂焦碳酸二乙酯（DEPC)是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。异硫氰酸胍目前被认为是最有效的RNA酶抑制剂，它在裂解组织的同时也使RNA酶失活。它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白体中解离出来，又对R

5、NA酶有强烈的变性作用。RNA酶的蛋白抑制剂(RNasin)从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一种非竞争性抑制剂，可以和多种RNA酶结合，使其失活。其他SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定抑制作用。防止RNA酶污染的措施所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6h或更长时间。塑料器皿可用0.1%DEPC水浸泡12h以上，高压灭菌。有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在3%H2O2室温10min，然后用0.1%DEPC水冲洗，晾干。配制的溶液应尽可能用0.1%DEPC在37℃处理12h以上。然后用高压灭菌除去残留

6、的DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经滤膜过滤除菌。操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，实验过程中手套要勤换。设置RNA操作专用实验室，所有器械等应为专用。操作步骤样品处理提取组织RNA时，每50～100mg组织用1mlTrizol试剂对组织进行裂解；悬浮细胞先离心沉淀，每5-10×106个细胞加1mlTrizol后，反复用枪吹打或剧烈振荡以裂解细胞。培养贴壁细胞不须消化，可直接用Trizol进行消化、裂解，Trizol体积按10cm2/ml比例加入。(注意：匀浆一定要彻底，是提取高质量RNA的前提；细胞数量与Trizol的比例，细胞的数量不能过

7、多。)实验材料：人胚胎肾细胞293操作步骤细胞或组织加Trizol（RNAisoPlus）后剧烈振荡15s，室温放置5min，使其充分裂解。（注意：此时可放入-70℃长期保持）按0.2ml氯仿/1mlTrizol加入氯仿(本实验加100μl)，剧烈振荡混匀后室温放置5min。(注意：此步振荡非常重要，建议在旋涡振荡器上进行。)4℃12,000g离心15min。样品分为三层：底层为黄色（红或绿）有机相，上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中，水相体积约为所用Tr