RNA提取-反转录-半定量PCR

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1、RNA提取原理及每个步骤的原理一、实验目的：提取组织中RNA，作为逆转录cDNA的原料二、实验原理：（异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法） a)TRIZOL试剂是直接从细胞或组织中提取总RNA的试剂，它在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性。试剂主要成分为异硫氰酸胍和苯酚，其中异硫氰酸胍可裂解细胞，促使核蛋白体的解离，使RNA与蛋白质分离，并将RNA释放到溶液中。加入氯仿后离心，样品分成水样层（无色）和有机层（黄色）。RNA存在于水样层中。收集上面的水样层后，RNA可以通过异丙醇沉淀来还原。在除去水样层后，样品中的DNA和蛋白

2、也能相继以沉淀的方式还原。乙醇沉淀能析出中间层的DNA，在有机层中加入异丙醇能沉淀出蛋白。三、实验材料：氯仿，异丙醇，Rnase-freeddH2O，75％乙醇（用Rnase-free水配制）四、实验步骤：（TIANGEN：PhaselockGelTMHenny配合TrizolA+提总RNA操作）1.匀浆处理（*打开离心机，降温）a)-80℃冻存组织，转移至普通2ml管中，每30mg组织加1mlTrizolA+。用匀浆仪匀浆，样品体积不超过TrizolA+体积的10％（注：先加700μlTrizolA+，再加300μl

3、，防止外溢；一般匀浆1.5~2min，可设Timer）裂解细胞，促使核蛋白体的解离，使RNA与蛋白质分离，并将RNA释放到溶液中2.将匀浆样品在20℃左右放置5min使RNA充分释放到溶液中1.将PhaselockGelTM(PLG)置于离心机中，15000Xg离心30s离心到底部，不让贴壁2.将第2步中的匀浆样品全部转移至离心后的PLG中，每1mlTrizolA+加入0.2ml氯仿，盖好管盖，剧烈震荡15s分层，PLG可在在水相和有机相之间形成一层致密的固体，将中间层的蛋白杂质和下层有机相完全锁在固体之下，这样，全部

4、水相样品可轻松吸出，完全不用担心混入杂质，也不用担心酚氯仿会不小心流出来。3.将样品室温放置2~3min使分层更彻底4.4℃，12000Xg离心15min，PLG会在有机相和水相之间形成致密的固相层PLG锁住可能污染核酸的杂质5.将PLG上层含RNA的水相转移至另一RnaseFree的离心管转移RNA6.向得到的水性溶液中加等体积的异丙醇，彻底混匀，室温放置30min沉淀还原RNA7.4℃，12000Xg离心10min，去上清从混合液中分离RNA8.加入1ml75％乙醇（用RnaseFree-ddH20配制），对沉淀进

5、行洗涤洗涤RNA沉淀9.4℃，7500Xg离心5min，倒出液体，不要将沉淀倒出从混合液中分离RNA10.室温放置晾干，每100ml组织+30μlRnaseFree-ddH20，混匀，充分溶解溶解RNA溶解RNA11.分装到小PCR管中，10μl，10μl，20μl，25μl（稀释30倍），用于测RNA含量。（如果RNA沉淀在1mm左右，可以加30μlddH2O，如果3mm左右，可加70μlddH2O；本次根据其大小加了35μlddH2O，10μl+10μl+10μl+5μl小PCR管测定RNA纯度12.紫外分光光度计

6、测RNA含量a)取2.5μl样液+72.5μlRnaseFree-ddH20稀释30倍混匀i.260：核酸最高吸收峰260/280=1.66280：蛋白最高吸收峰RNA的260/280应>2.0，偏小则说明蛋白质量较高测定RNA纯度1.跑胶（见下次）测定RNA纯度附录：此次实验结果：59.4mg/μl20.5260/28059.4mg/μl0.83260/2301.812A2301.510A2000.750A2500.024A320A280核酸A320背景（溶液浑浊度）A230盐浓度A260蛋白等有机物a)A260/2

7、80=1.8~2.0RNA质量较好，RNA中蛋白质或其他有机物的污染可以容忍260/280<1.8.溶液中蛋白质或其他有机物的污染较明显260/280>2.2.RNA已水解为单核苷酸b)TrizolA+可保持RNA的完整性，同时裂解细胞，溶解细胞内含物加入氯仿后，溶液分为水相（含RNA）、有机相（蛋白）、中间层（DNA）乙醇沉淀异丙醇沉淀异丙醇沉淀回收DNA回收蛋白回收RNAa)PhaselockGelTM(PLG)：可在水相和有机相之间形成致密固体RNA质量和浓度鉴定1、RNA跑电泳RNA电泳的理想带型是：1.完整的

8、RNA琼脂电泳会有三条带，某些试剂盒可能只有两条（没有最下面的5S条带）2.上面两条带最亮，分别代表28S和18SrRNA。且第一条带（28S）应该为第二条带（18S）的亮度约两倍。最下面一条带最淡，为5S条带。3.如果你发现最下面一条带很亮而上面两条带很淡甚至没有，那就说明你的RNA发生了严重的降解。只能重新提取了。4.但如果仅