天根--“从RNA提取到荧光定量PCR”解决方案

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1、“从RNA提取到荧光定量PCR”解决方案――qPCR―qPCR系统TIANGENBIOTECH(BEIJING)CO.,LTD内容概要
荧光定量PCR的原理
荧光定量PCR的标记方法
荧光定量PCR解析方法
SYBR法实验流程及注意事项
TIANGEN公司荧光定量产品选择指南荧光定量PCR原理－－定义实时定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的关系对起始模板进行定量分析与常规PCR技术比较：对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析，无法对起始模板

2、准确定量，无法对扩增反应实时检测荧光定量PCR原理－－常用名词概念扩增曲线荧光阈值Ct值荧光定量PCR原理－－扩增曲线平台期荧光基团）荧光强度（RnLog－－－linerphaseBaselineCycle（（（循环数（循环数循环数）循环数）））荧光检测元件荧光定量PCR原理－－荧光域值
前15个循环信号作为荧光平台期本底信号（baseline）
荧光域值的缺省设置是）荧光强度3～15个循环的荧光信号的标（Rn准偏差的10倍Log－－－linerphase
手动设置：大于荧光背景Threshold值和阴性对照的

3、荧光最高值；进入指数期的最初阶段
真正的信号:荧光信号超Baseline过域值Cycle（（（循环（循环数数数）数）））荧光定量PCR原理－－CtCt值Ct值）荧光强度Ct值的定义：（RnPCR扩增过程中，扩Ctvalue增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数Cycle（（（循环（循环数数数）数）））荧光定量PCR原理－－CtCt值定量的数学原理Ct值定量的数学原理理想的PCR反应X＝X2nn0*n：：扩增循环数：扩增循环数X0：：起始模板数量：起始模板数量X：：第：第n次循环后扩增产物数量n荧光定量P

4、CR原理－－CtCt值定量的数学原理Ct值定量的数学原理非理想的PCR反应nXn＝X0*（1＋En）n：：扩增循环数：扩增循环数En：：扩增效率：扩增效率X0：：起始模板数量：起始模板数量X：：第：第n次循环后扩增产物数量n荧光定量PCR原理－－CtCt值定量的数学原理Ct值定量的数学原理在扩增产物达到荧光阈值时CtXCt＝X0*（1＋En）＝M（1）XCt：：：荧光扩增信号达到阈值时扩增产物的量：荧光扩增信号达到阈值时扩增产物的量荧光扩增信号达到阈值时扩增产物的量，荧光扩增信号达到阈值时扩增产物的量，，，在阈值设定

5、以后在阈值设定以后在阈值设定以后，在阈值设定以后，，，它是一个常数它是一个常数它是一个常数，它是一个常数，，，定为定为M方程式（1）两边同取对数得：CtLogM＝LogX0*（1＋En）（2）整理方程式（2）：LogX0＝LogM－CtLog（1＋En）荧光定量PCR原理－－CtCt值与模板起始量的关系Ct值与模板起始量的关系SampleCk102Ck104模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少，即Ct值越小。Log模板起始浓度与Ct值呈线性关系。CyclenumberLogofDNAconcentratio

6、n荧光定量PCR反应性的确认线性关系、、扩增效率确认、扩增效率确认相关系数（（R（RRR222）：大于0.98标准曲线斜率:::-:---3333－－－-－---3.53.5PCRPCR扩增效率PCR扩增效率（（E（EEE）））:0.9）:0.9:0.9-:0.9---1.21.2检测灵敏度确认35Cycles35Cycles内35Cycles内内可得到好的定量结果内可得到好的定量结果如果采用SYBRSYBR检测方法SYBR检测方法，，30Cycles，30Cycles30Cycles内30Cycles内无非特异性产

7、物扩增NotemplatecontrolNotemplatecontrol确认Notemplatecontrol确认35Cycles35Cycles内无引物二聚体产生35Cycles内无引物二聚体产生荧光定量PCR技术的应用定性分析研究：：杂合或纯合子鉴定：，（SNPs）分析等绝对定量研究：：病毒和病原菌定量分析：，基因拷贝数定量，GMO定量检测等相对定量研究：mRNA表达量分析，siRNA效果确认，基因芯片结果验证，差异显示结果验证等内容概要
荧光定量PCR的原理
荧光定量PCR的标记方法
荧光定量PCR的解

8、析方法
SYBR法实验流程及注意事项
TIANGEN公司荧光定量产品选择指南常用荧光标记方法非特异性荧光标记SYBRGreenI特异性荧光标记TaqManProbeSYBRGreenI染料法——原理SYBRGreenI是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。SYBRGreenISYBRGreenISYBRGreen