荧光定量pcr实验指南

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1、荧光定量PCR实验指南（一）一、        基本步骤：1、           目的基因（DNA和mRNA）的查找和比对；2、           引物、探针的设计；3、           引物探针的合成；4、           反应体系的配制；5、           反应条件的设定；6、           反应体系和条件的优化；7、           荧光曲线和数据分析；8、           标准品的制备；二、        技术关键：1、目的基因（DNA和mRNA）的查找和比对；从http://www.ncbi.nlm.nih.gov/网点的genbank中下载所需要

2、的序列。下载的方式有两种：一为打开某个序列后，直接点击“save”，保存格式为“.txt”文件。保存的名称中要包括序列的物种、序列的亚型、序列的注册号。然后，再打开DNAstar软件中的Editseq软件，点击“file”菜单中的“import”，打开后点击“save”，保存为“.seq”文件。另一种直接用DNAstar软件中的Editseq软件，点击“file”菜单中的“openentrezsequence”，导入后保存为“.seq”文件，保存的名称中要包括序列的物种、序列的亚型、序列的注册号。然后要对所有的序列进行排序。用DNAstar软件中的Seqman软件，点击“sequence”

3、菜单中的“add”，选择要比较的“.seq”的所有文件，点击“add”或“addall”，然后点击“Done”导入要比较的序列，再点击“assemble”进行比较。横线的上列为一致性序列，所有红色的碱基是不同的序列，一致的序列用黑色碱基表示。有时要设定比较序列的开始与结尾。有时因为参数设置的原因，可能分为几组(contig)，若想全部放在一组中进行比较，就调整“project”菜单下的“parameter”，在“assembling”内的“minimummathpercentage”默认设置为80，可调低即可。再选择几个组，点击“contig”菜单下的“reassemblecontig”即

4、可。选择高低的原则是在保证所分析的序列在一个“contig”内的前提下，尽量提高“minimummathpercentage”的值。有时因此个别序列原因，会出现重复序列，碱基的缺失或插入，要对“contig”的序列的排列进行修改，确保排列是每个序列的真实且排列同源性最好的排列。然后，点击“save”保存即可。分析时，主要是观察是否全部为一致性的黑色或红色，对于弥散性的红色是不可用的。2、引物和探针设计2.1引物设计  细心地进行引物设计是PCR中最重要的一步。理想的引物对只同目的序列两侧的单一序列而非其他序列退火。设计糟糕的引物可能会同扩增其他的非目的序列。下面的指导描述了一个可以增加特异

5、性的引物所具有的令人满意的特点：²           序列选取应在基因的保守区段；²           扩增片段长度根据技术的不同有所分别：sybrgreenI技术对片段长度没有特殊要求；Taqman探针技术要求片段长度在50bp－150bp；²           避免引物自身或与引物之间形成4个或4个以上连续配对；²           避免引物自身形成环状发卡结构；²           典型的引物18到24个核苷长。引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。但是长度大于24核苷的引物并不意味着更高的特异性。较长的序列可能会与错误配对序列杂交，降低了

6、特异性，而且比短序列杂交慢，从而降低了产量。Tm值在55－65℃，GC含量在40%－60%；²           引物之间的TM相差避免超过2℃；²           引物的3’端避免使用碱基A；²           引物的3’端避免出现3个或3个以上连续相同的碱基。²           为避免基因组的扩增，引物设计最好能跨两个外显子。2.2 Taqman探针设计一般设计原则：²           探针位置尽可能地靠近上游引物；²           探针长度通常在25－35bp，Tm值在65－70℃，通常比引物TM高5－10℃，GC含量在40%－70%。²           

7、探针的5’端应避免使用碱基G。²           整条探针中，碱基C的含量要明显高于G的含量。²           为确保引物探针的特异性，最好将设计好的序列在blast中核实一次，如果发现有非特异性互补区，建议重新设计引物探针。(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)2.3 Taqman MGB探针设计介绍MGB探针的优点：²           MGB探针较短(14-20bp)，更容易找到所有排