荧光定量pcr,实验报告

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1、为了适应公司新战略的发展，保障停车场安保新项目的正常、顺利开展，特制定安保从业人员的业务技能及个人素质的培训计划荧光定量pcr,实验报告　　荧光定量PCR实验报告　　目前需要检测抗癌药A在不用时间点对某抑癌基因B表达的影响，根据该药物在文献记录中发挥作用的时间点0小时，6小时，24小时给予药物，并已提取各时间点细胞的总RNA，请设计相关实验来检测药物A对基因B转录水平影响。　　一、实验原理　　所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未

2、知模板进行定量分析的方法。　　研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。　　荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种：荧光探针和荧光染料。本实验主要采用SYBR荧光染料。在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不

3、会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。二、实验试剂和器材目的-通过该培训员工可对保安行业有初步了解，并感受到安保行业的发展的巨大潜力，可提升其的专业水平，并确保其在这个行业的安全感。为了适应公司新战略的发展，保障停车场安保新项目的正常、顺利开展，特制定安保从业人员的业务技能及个人素质的培训计划　　因RNA已提取，即应准备反转录和做PCR的试剂：　　逆转录酶，核糖核酸酶抑制剂，dNTP，TaqDNA聚合酶，随机引物，琼脂糖均为美国Promega公司产品；荧光定量试剂盒：HotStart

4、FluorescentPCRCoreReagentKits(SYBRGreenI),BBI公司，合适的抑癌基因A的引物、β-actin引物。　　器材：　　ABI7300Real-TimePCRSystemRS-28高速低温离心机超低温冰箱微量移液器　　三、实验步骤　　，根据该药物在文献记录中发挥作用的时间点,用抗癌药A在0小时，6小时，24小时给予药物，并已提取各时间点细胞的总RNA反转录:反转录反应液组成如下表：　　Table1MixedcomponentsforsynthesisofcDNAfirstchain

5、　　Component5×*dNTP　　Volume5　　Concentration1×10?M/??l　　RNasinRNA　　RandomPrimerM-MLV　　Nucleasr-FreeWaterTotal　　21625目的-通过该培训员工可对保安行业有初步了解，并感受到安保行业的发展的巨大潜力，可提升其的专业水平，并确保其在这个行业的安全感。为了适应公司新战略的发展，保障停车场安保新项目的正常、顺利开展，特制定安保从业人员的业务技能及个人素质的培训计划　　20U/??l??g/??l5U/??l　　42℃

6、反转录50min，95℃5min灭活反转录酶。　　SyberGreen荧光定量PCR检测：在冰上按下表加样，　　PCR反应液组成如下表：　　Table2Mixedcomponentsforpolymerasechainreaction　　Component2×MasterMixPrimerH2OTotal　　PCR板的设置如图中所示：　　PCR热循环参数：96℃4min，然后三步反应：94℃30S，58℃30s，72℃30s，进行40　　Volume1101+1720　　个循环，于每个循环的第三步即：72℃30s收

7、集荧光信号。最后在72℃保温7min。3．结束反应，PCR产物放置于4℃待电泳检测或-20℃长期保存。　　四、实时荧光定量PCR结果分析:　　扩增完毕后，进入结果分析界面，看CT值、起始拷贝数、标准偏差等　　，如果是SYBR做的话，再看下溶解曲线。以β-actin为内参照基因，与对照组相比，得到目的基因表达的相对定量值，将RQ值用于统计分析。　　五、注意事项　　１．PCR反应应该在一个没有DNA污染的干净环境中进行。最好设立一个专用的PCR实验室。目的-通过该培训员工可对保安行业有初步了解，并感受到安保行业的发展的

8、巨大潜力，可提升其的专业水平，并确保其在这个行业的安全感。为了适应公司新战略的发展，保障停车场安保新项目的正常、顺利开展，特制定安保从业人员的业务技能及个人素质的培训计划　　２．纯化模板所选用的方法对污染的风险有极大影响。一般而言，只要能够得到可靠的结果，纯化的方法越简单越好。　　３．所有试剂都应该没有核酸和核酸酶的污染。操作过程中均应戴手套。　　４．PCR