天根荧光定量PCR技术专题NEW

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1、“从RNA提取到荧光定量PCR”解决方案――qPCR―qPCRqPCR系统qPCR系统TIANGENBIOTECH(BEIJING)CO.,LTD内容概要
荧光定量PCR的原理
荧光定量PCR的标记方法
荧光定量PCR解析方法
SYBR法实验流程及注意事项
TIANGEN公司荧光定量产品选择指南荧光定量PCR原理－－定义实时定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的关系对起始模板进行定量分析与常规PCR技术比较：对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析，无法对起始模板准确

2、定量，无法对扩增反应实时检测荧光定量PCR原理－－常用名词概念扩增曲线荧光阈值Ct值荧光定量PCR原理－－扩增曲线平台期）荧光基团荧光强度（RnLog－－－linerphaseBaselineCycle（（（循环数（循环数）））荧光检测元件荧光定量PCR原理－－荧光域值
前15个循环信号作为荧光平台期本底信号（baseline））
荧光域值的缺省设置是荧光强度3～15个循环的荧光信号的标（Rn准偏差的10倍Log－－－linerphase
手动设置：大于荧光背景Threshold值和阴性对照的荧光最高值；进入指数期的最初阶段
真正的信

3、号:荧光信号超Baseline过域值Cycle（（（循环数（循环数）））荧光定量PCR原理－－CtCt值Ct值）荧光强度Ct值的定义：：：（RnPCR扩增过程中，扩Ctvalue增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数Cycle（（（循环数（循环数）））荧光定量PCR原理－－CtCt值定量的数学原理Ct值定量的数学原理理想的PCR反应X＝X2nn0*n：：扩增循环数：扩增循环数X0：：起始模板数量：起始模板数量X：：第：第n次循环后扩增产物数量n荧光定量PCR原理－－CtCt值定量的数学原理Ct值定量的数学原理非理想的PCR反应

4、nXn＝X0*（1＋En）n：：扩增循环数：扩增循环数En：：扩增效率：扩增效率X0：：起始模板数量：起始模板数量X：：第：第n次循环后扩增产物数量n荧光定量PCR原理－－CtCt值定量的数学原理Ct值定量的数学原理在扩增产物达到荧光阈值时CtXCt＝X0*（1＋En）＝M（1）XCt：：：荧光扩增信号达到阈值时扩增产物的量：荧光扩增信号达到阈值时扩增产物的量，，，在阈值设定以后，在阈值设定以后，，，它是一个常数，它是一个常数，，，定为，定为M方程式（1）两边同取对数得：CtLogM＝LogX0*（1＋En）（2）整理方程式（2）：LogX

5、0＝LogM－CtLog（1＋En）荧光定量PCR原理－－CtCt值与模板起始量的关系Ct值与模板起始量的关系SampleCk102Ck104起始模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少，即Ct值越小。Log模板起始浓度与Ct值呈线性关系。CyclenumberLogofDNAconcentration荧光定量PCR反应有效性的确认线性关系、、扩增效率确认、扩增效率确认相关系数（（（R（RRR222）：大于0.98标准曲线斜率:::-:---3333－－－－----3.53.5PCRPCR扩增效率PCR扩增效率（（（E（EEE））））

6、:0.9:0.9:0.9-:0.9---1.21.2检测灵敏度确认35Cycles35Cycles内35Cycles内内内可得到好的定量结果可得到好的定量结果如果采用SYBRSYBR检测方法SYBR检测方法，，，30Cycles，30Cycles30Cycles内无非特异性产物扩增30Cycles内无非特异性产物扩增35Cycles35Cycles内无引物二聚体产生35Cycles内无引物二聚体产生荧光定量PCR技术的应用定性分析研究：：杂合或纯合子鉴定：，（SNPs）分析等绝对定量研究：：病毒和病原菌定量分析：，基因拷贝数定量，GMO

7、定量检测等相对定量研究：mRNA表达量分析，siRNA效果确认，基因芯片结果验证，差异显示结果验证等内容概要
荧光定量PCR的原理
荧光定量PCR的标记方法
荧光定量PCR的解析方法
SYBR法实验流程及注意事项
TIANGEN公司荧光定量产品选择指南常用荧光标记方法非特异性荧光标记SYBRGreenI特异性荧光标记TaqManProbe分子信标SYBRGreenI染料法——原理SYBRGreenI是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。SYBRGreenISYBRGreenISYBRGreenI染料法——

8、作用机理热变性引物退火延伸反应SYBRGreenI染料法——问题点与关键点问题点：SYBRGreenI与任何双链DNA进行结合后散发荧光，，因，因此如果反应体系中有非特异性扩增或