荧光定量PCR技术专题.ppt

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1、TIANGENBIOTECH(BEIJING)CO.,LTD―qPCR系统“从RNA提取到荧光定量PCR”解决方案内容概要荧光定量PCR的原理荧光定量PCR的标记方法荧光定量PCR解析方法SYBR法实验流程及注意事项TIANGEN公司荧光定量产品选择指南实时定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的关系对起始模板进行定量分析与常规PCR技术比较：对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析，无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测荧光定量PCR原理－－定义扩增曲线荧光阈值Ct值荧光定量PC

2、R原理－－常用名词概念Cycle（循环数）Rn（荧光强度）BaselineLg－linerphase平台期荧光基团荧光检测元件荧光定量PCR原理－－扩增曲线Cycle（循环数）Rn（荧光强度）BaselineLg－linerphase前15个循环信号作为荧光本底信号（baseline）荧光阈值的缺省设置是3～15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍手动设置：大于荧光背景值和阴性对照的荧光最高值；进入指数期的最初阶段真正的信号:荧光信号超过阈值Threshold荧光定量PCR原理－－荧光阈值平台期Ct值的定义：PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所

3、经过的扩增循环次数Cycle（循环数）Rn（荧光强度）Ctvalue荧光定量PCR原理－－Ct值横轴：PCR反映循环数纵轴：荧光信号量Ct值的特点：相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定；Ct值极具重现性Ct值的重现性理想的PCR反应Xn＝X02n*Xn：第n次循环后扩增产物数量X0：起始模板数量n：扩增循环数荧光定量PCR原理－－Ct值定量的数学原理非理想的PCR反应Xn＝X0（1＋En）n*Xn：第n次循环后扩增产物数量X0：起始模板数量n：扩增循环数En：扩增效率荧光定量PCR原理－－Ct值定量的数学原理在扩增产物达到荧光阈值时XCt＝X0（1＋En

4、）Ct＝M（1）*XCt：荧光扩增信号达到阈值时扩增产物的量，在阈值设定以后，它是一个常数，定为M方程式（1）两边同取对数得：Log2M＝Log2X0*（1＋En）Ct（2）整理方程式（2）：Log2X0＝Log2M－CtLog2（1＋En）荧光定量PCR原理－－Ct值定量的数学原理CyclenumberCk104Ck102SampleLgofDNAconcentration模板DNA量越多，荧光达到阈值的循环数越少，即Ct值越小。Log模板起始浓度与Ct值呈线性关系。荧光定量PCR原理－－Ct值与模板起始量的关系线性关系、扩增效率确认检测灵敏度确认Notem

5、platecontrol确认标准曲线斜率:-3－-3.535Cycles内可得到好的定量结果如果采用SYBR检测方法，30Cycles内无非特异性产物扩增35Cycles内无引物二聚体产生相关系数（R2）：大于0.98荧光定量PCR反应性的确认PCR扩增效率（E）:0.9-1.2内容概要荧光定量PCR的原理荧光定量PCR的标记方法荧光定量PCR解析方法SYBR法实验流程及注意事项TIANGEN公司荧光定量产品选择指南非特异性荧光标记SYBRGreenI特异性荧光标记TaqManProbe常用荧光标记方法SYBRGreenI染料法——原理SYBRGreenI是一

6、种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。SYBRGreenI热变性引物退火延伸反应SYBRGreenI染料法——作用机理问题点：SYBRGreenI与双链DNA进行结合后散发荧光，因此如果反应体系中有非特异性扩增或引物二聚体的产生，也将同时被检测，从而可能导致检测结果不准确。SYBRGreenI染料法——问题点与关键点关键点：设计合适引物，防止非特异性扩增！将温度与荧光强度的变化求导(-dI/dT)原始图谱对数图谱SYBRGreenI染料法——融解曲线融解曲线分析，单一峰无非特异性荧光定量准确融解曲线分析，出现杂峰其他产物出现非特异性荧光

7、，因此定量不准确SYBRGreenI染料法——融解曲线使用方便，不必设计复杂探针具有价格优势优点无模板特异性对引物特异性要求较高不能进行多重定量灵敏度相对较低缺点SYBRGreenI染料法——优缺点Taqman探针法——原理5′端标记有报告基团(Reporter,R)，如FAM、VIC等3′端标记有荧光淬灭基团(Quencher,Q)探针完整，R发射的荧光能量被Q基团吸收，无荧光，R与Q分开，发荧光Taq酶有5′→3′外切核酸酶活性，可水解探针Taqman探针法——工作机理热变性引物和探针与模板退火延伸反应探针报告基团淬灭基团探针DNA聚合酶引物RRRR1、引

8、物、探针的设计：探针Tm为68-70℃