荧光定量PCR技术学习资料.ppt

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1、荧光定量PCR技术普通PCR临床检测技术的缺点普通PCR临床检测技术虽然解决了检出率低、周期长的问题，但由于假阳性率高，不能正确指导临床实践。因此国家卫生部曾在1997年行文禁止将普通PCR技术用于临床诊断。2FQ-PCR与普通PCR的区别采用闭管检测，不需PCR后处理，并采用dUTP-UNG酶的防污染系统，扩增和检测一次同时完成。不需开盖，不产生污染。避免了假阳性。探针与被检DNA序列特异杂交，增强了特异性。3FQ-PCR与普通PCR的区别可定量结果，准确灵敏地反应了病原体的感染和治疗恢复情况。光谱分析仪直读结果，自动分析，增强了灵敏性和客观性。4荧光基因探针杂交定量PCR

2、技术随着PCR技术的日臻成熟，已出现的荧光基因探针杂交定量PCR方法把目的基因扩增、特异分子杂交和荧光化学融为一体，使PCR扩增和产物分析的全过程均在单管封闭条件下进行，　并通过微机控制，实现了对扩增产物进行实时　动态检测和结果的自动分析。5荧光基因探针杂交定量PCR技术不仅进一步提高了特异性，并从根本上解决了PCR扩增产物污染的难题，保持了PCR技术的快速和高灵敏性，使假阳性率和假阴性率降低到最低限度，而且能定量被检微生物的核酸拷贝数，为临床实践提供准确的病原微生物的诊断、提供评估药物临床治疗效果的可靠依据。因此，荧光基因探针杂交定量PCR技术诊断病原微生物与迄今本院各临床

3、科室所进行的临床检测技术不相重复，它是一种属不同层次、快速、准确、直接并具有不同临床指导意义的检测方法。6荧光定量聚合酶链反应（FQ-PCRFluorescencequantitativePCR）一种完全闭管式的PCR和荧光探针杂交技术相结合的定量PCR方法PCR的高效扩增特性核酸探针的高特异性光谱技术的高灵敏性和可计量性7荧光基因探针杂交定量PCR技术与临床在确保特异性的前题下，高质的灵敏性使得PCR技术能探测到疾病发展的初期阶段，甚至于临床症状出现前或亚临床状态或机体正在向病态发展的早期过程之中，如对于感染性疾病，以往的方法要么间接的检查机体免疫系统对侵入微生物的反应产物

4、降解产物（如抗原）或直接检查侵入微生物（如培养，镜检），但上述方法的灵敏度都受到方法学上的限制而达不到检查极微量级（如Pg水平），因而难以在早期对疾病的发生做出准确，客观的诊断，但PCR巨大的放大效率却解决了这一问题。8荧光基因探针杂交定量PCR技术与临床另外如对像肿瘤等“渐变性”疾病是因多基因积累性突变才能造成正常细胞转变成癌细胞的，那么及时检测到突变由量变转化为质变前期阶段则显得极为重要，只有基因诊断才能完成这一目标。9荧光定量PCR检测的对象是致病的病因，所以对于鉴别疾病的致病因子非常实用和准确，这对于区别相近临床症状的不同致病子，以期对因治疗极为有用。荧光定量PCR可

5、以对致病因子进行准确的定量，对治疗前后及治疗过程进行量化监控，则可以有效的观察药物治疗效果。如果用致病子的数量多少表示治疗效果，则可以进行临床治疗方案的评价及治愈标准的确立。10荧光定量PCR检测的临床应用范围用于疾病的早期诊断用于疾病的鉴别诊断用于疾病的病因确定用于药物疗效的评价用于治疗效果的评价用于治愈标准的确定11荧光定量PCR技术应用于感染性疾病的诊断12结核杆菌的临床诊断方法目前结核病确诊主要依靠痰片染色，抗酸杆菌和结核杆菌的培养法鉴定。但涂片阳性率不高，且不能确诊；培养法需较长时间。ELISA和RIA法敏感性低，尚不能直接检测临床标本。近年来国外出现了培养早期进行

6、放射性检测的BacTec技术，能显著缩短报告时间，但价格极贵，国内很难推广。基因诊断技术的应用是一大突破，其中包括基因探针技术，染色体指纹技术和荧光定量PCR技术。13.北京胸科医院;北京市结核病胸部肿瘤研究所;上海肺科医院三家医院的考核情况。三家医院标本分布医院结核组351例对照组160例例数涂阳培阳北京胸科143364260北京结研所151403150上海肺科57572950结核分枝杆菌(TB)FQ-PCR检测与常规检测比较14FQ-PCR法与涂片法、培养法的检出率比较组别涂片法培养法FQ-PCR法例数阳性检出率阳性检出率阳性检出率结核病组35113337.9%10229

7、.1%22062.7%对照组16000%00%00%15荧光定量PCR技术检测结核杆菌应用评价1.特异性★人型结核杆菌，牛型结核杆菌及卡介菌均可扩增检测出，其它分支杆菌均否。2.敏感性★可检测1pgDNA，其相当于30个结核杆菌的染色体DNA量。3.临床应用★快速★可检测无法培养的结核杆菌16临床上，结核性脑膜炎是小儿多发病，病情凶险，所以早期快速诊断具有重要意义，而荧光定量PCR方法整个过程才4~5小时，远较细胞培养法为快，而且准确。检测标本无特殊限制：痰、尿、腹水、胸水、关节液、血、肺泡灌洗液、脑脊