RNA提取及PCR相关技术.ppt

《RNA提取及PCR相关技术.ppt》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、RNA提取逆转录实验步骤结果分析PCRqPCR内容从RNA提取到基因定性/定量流程收集并保存组织、血液、细胞等临床样本提取、纯化RNA逆转录生成cDNAPCR/qPCR进行定性/定量分析样本保存要求最好使用新鲜样品组织：取样离体后，立即分成1cm3左右的小块，每块约30-100mg，放入冻存管或锡箔纸包好，立即放置液氮罐中速冻1小时，-80℃冰箱保存。注意做好标记，避免反复冻融第一部分RNA提取RNA提取样本保存要求细胞：不建议保存。培养处理后立即提取RNA，或收集后，于Trizol液中-80℃保存。血液

2、：不建议长期保存。或立即分离白细胞后，于Trizol液中-80℃保存。试剂耗材准备工作目的：去除RNase，防止RNA降解♦各种离心管、Tip头、冷冻保存管等塑料器皿：浸泡在0.1%的DEPC水中，过夜处理，次日烘干，高压灭菌后再次烘干。♦锡箔纸、玻璃匀浆管、研钵、手术剪刀、镊子、移液管等玻璃、金属及陶瓷制品：用锡箔纸严密包裹后，150℃高温烘烤4小时。前期准备工作♦RNase-free水：0.1％DEPC处理去离子水过夜，次日高压灭菌除去残留DEPC，分装1.5mlEppendorf管，4℃保存。♦75

3、％乙醇：用RNase-free水配制，分装为50ml，4℃保存。♦氯仿、异丙醇、无水乙醇：新包装开封后，分装50ml，4℃保存。注意：DEPC有吸入毒性，需穿工作服，戴手套、口罩操作。样本准备组织大鼠组织样品量总RNA量（µg）脑10mg8肺10mg10肾脏10mg10心脏10mg20脾脏10mg35肝脏10mg4050－100mg组织对应1mlTrizol样本准备细胞♦悬浮细胞：生长对数期诱导后，5000×g，5min离心去除培养基，收集约5-10×106个细胞。每5-10×106个细胞对应1mlTri

4、zol♦贴壁细胞：生长对数期诱导后，收集约5-10×106个细胞，倒掉培养基，加入预热PBS洗一次，去除PBS。每10cm2培养面积对应1mlTrizolRNA的提取注意佩戴口罩、勤更换手套组织（1）液氮预冷研钵；（2）液氮研磨，至样品呈粉末状（需8-10min）；（3）向研钵内加入1mlTrizol继续研磨，至呈不黏稠液态；（4）将混合液转移至玻璃匀浆器中，冰上匀浆3min；（5）将匀浆液转移至1.5mlEppendorf管，室温孵育5min；裂解RNA的提取细胞悬浮细胞：离心收集后，倒除培养液，加入1

5、mlTrizol反复吹打细胞，至溶液不黏稠。贴壁细胞：倒除培养液，PBS洗涤一次后，直接在培养瓶或培养板中加入1mlTrizol反复吹打细胞，直至溶液不黏稠。室温孵育混合液10min后，转移至1.5mlEppendorf管裂解Trizol匀浆孵育后－80℃保存加入0.2ml氯仿，剧烈摇动15s;3minatRT,12,000gx15min,4℃分层取水相，0.5mL异丙醇，颠倒混匀，10minatRT4℃，12,000gx10min（片状沉淀物为RNA）沉淀去上清，1ml75％乙醇洗涤，7,500gx5m

6、inat4℃，重复一次洗涤空气干燥，加50ulRNase-free水，55℃孵育溶解干燥溶解RNA提取优化步骤（1）对得率较低的样本，可在异丙醇沉淀一步，选用-20度过夜孵育，以增加得率。（2）对多糖含量较高的样本，可在异丙醇沉淀一步，加入高盐溶液（0.8M柠檬酸钠和1.2MNaCl），-20度过夜共孵育，以去除多糖物质的污染。注意：所有试剂均需无酶水配制。RNA鉴定及初定量（1）测量OD值——得率及纯度检测得率总RNA浓度（ug/ml）＝OD260×稀释倍数×40ug/ml（通常OD260数值介于0.1

7、5-1.0之间才可靠）纯度OD260/280检测RNA纯度值在1.8-2.1之间，RNA纯度较好；值小于1.8，表明蛋白杂质较多；值大于2.2，表明RNA已降解；RNA鉴定及初定量（2）琼脂糖凝胶电泳——RNA完整性鉴定1－3ulRNA溶液上样，1％胶，100V电泳10min。完整RNA呈现明显两条带28S，18S，且28S带约为18S带亮度的两倍；有时也可见5S带RNA鉴定及初定量ElectrophoresisgeloftheRNAsample小结－RNA的保护1.提取前1.1新鲜样品及液氮速冻1.2提

8、取工作区RNase的清除1.3实验用品RNase的清除2.提取中2.1组织破碎过程中的保护2.2细胞裂解过程中的保护2.3实验人员保护措施2.4保存过程中3.在后续的逆转录过程中仍需保持无酶环境第二部分RT-PCR逆转录PCRreversetranscriptionAAAAAAAAAA-3’TTTTTTTTTT-5’mRNA(sense)Antisenseprimers:oligo(dT)orrandomhexamersorG