TD-PCR及提取细胞RNA过程.docx

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1、搜狐博客>众览天下>日志2006-08-15 

2、 TD-PCRTD-PCR实验步骤，可能共11步骤，过程如下：1.95预变性，2.94变性，30S3.6530S4.72延伸，30S5.goto2，降0.5度/cycle，共（最高温-最低温）X2cycleS（根据你自己的情况可以最高温＋3＝68，最低温-5＝51，循环数该是34）6.72延伸5分7.4度foreverOD260/OD280纯DNA的A260/A280应大于1.8，纯的RNA应达到2.0，样品中如果含有蛋白质及苯酚，A260/A280比值会

3、明显下降。对于纯的样品，只要读出260nm的A值即可以算出含量。通常以A值为1相当于50微克/ml双螺旋DNA，或者40微克/ml单链DNA（RNA），或者20微克/ml寡核苷酸计算。提取细胞RNA的过程和照片，1、冰冷的PBS液5-10ml洗涤细胞两次，加入Trizol1ml，混匀，室温静置15min；这是加入Trizol以后的照片       ２、小滴管吹打，使细胞完全裂解，然后完全转移至1.5mlEP管内  3、加入0.2ml的氯仿，剧烈震荡混匀30s。有人喜欢室温静置10min，有人直接去离心也

4、没问题。偶愿意室温静置10min，看自动分层了，上层水相，下层为酚相。    4、4度离心，15000rpm，15min，看看中间白的是蛋白层，上层为水相。    5、将上层水相移至另一EP管内，400-500ul，不要贪多，小心切勿吸到蛋白，加入等量的异丙醇，充分混匀，室温静置10min。然后4度，15000rpm，离心10min，然后管底可以看到RNA噢！看看图，我加了个圈。     6、弃掉上清，加入冰冷的75%乙醇漂洗两次，用移液器将液体吸干，室温干燥10-20分钟，待产物呈半透明状，加入10u

5、l～30ulDEPC处理过的水溶解RNA。6、弃掉上清，加入冰冷的75%乙醇漂洗两次，用移液器将液体吸干，室温干燥10-20分钟，待产物呈半透明状，加入10ul～30ulDEPC处理过的水溶解RNA。(提RNA所用试验物品均需经0.1%DEPC水处理后消毒、烤干。所需试剂如75%乙醇需用无水乙醇加灭菌的DEPC水配制，为保证RNA提取过程中，RNA可被空气中RNA酶降解，应勤换手套，戴口罩)巢式PCR可以提高特异性和灵敏度。第一轮是15到20个循环的标准扩增。然后，将一小部分扩增产物稀释100倍；或者通

6、过凝胶纯化扩增产物再稀释100倍（推荐）。加入到第二轮扩增中。在第二轮扩增中使用第一轮引物内侧的引物结合，再进行15到20个循环。巢式PCR相当于增加了引物的实际长度以提高特异性；增加了扩增的循环数以提高灵敏度。反应体系一般没有特殊要求，同普通PCR。