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1、科技情报开发与经济SCI-TECHINFORMATIONDEVELOPMENT&ECONOMY2008年第18卷第10期文章编号:1005-6033(2008)10-0206-02收稿日期:2008-03-03RNA的提取及3种RNA提取试剂盒的比较曹建斌(运城学院生命科学系,山西运城,044000)摘要:概述了RNA的提取以及一些注意事项,并对实验室常用的3种RNA提取试剂盒进行了比较。关键词:RNA提取;纯化;试剂盒中图分类号:Q75文献标识码:ARNA分子的分离提取是分子生物学研究中的基本内容,是进行基因纯化的mRNA可用于以下的实验,如RT-PCR,Norther
2、n印迹分析,表达分析的基础。典型的哺乳动物细胞中含有的RNA大约为10-5!g,其cDNA文库构建,mRNA末端快速扩增(RACE),差异表达(DDRT-PCR),中80%～85%是核糖体RNA(主要是28S,18S,5.8S和5S四种),剩余的引物延伸反应(PrimerExtension),RNA标志(RNAlabeling)等。15%～20%中大部分是由不同的低相对分子质量的RNA(转运RNA和小1.3RNA的定量与纯度核RNA)组成,另外,还有1%～5%的信使RNA(mRNA)。在细胞内mRNA若RNA样品较纯,通常用分光光度法来定量测定,测量在260nm虽然含量少
3、,碱基组成及长度各异,但是这些mRNA分子实际上编码了波长处的吸收值(A260)。若样品中RNA含量较低或含有较多的杂质,则细胞内所有的多肽分子。我们研究细胞内基因的表达量,通常要提取分光光度法不能用于RNA的定量测定。因此,RNA提取结束后,要根RNA分子来进行研究,细胞内RNA分子的多样性和易被降解决定了其据大概产量稀释(一般用10mMTris.HCl,pH值为7.0来稀释)到适当提取过程的复杂性。本文介绍了RNA提取、纯化的一般步骤及其注意事浓度范围,再用分光光度计测量。A260=1相当于RNA的质量浓度为40项,并对3种RNA提取试剂盒进行了比较。!g/mL。检测
4、RNA的纯度,可以利用A260与A280两处读数的比值来估计1RNA的提取RNA的纯度。通常纯制品RNA的A260/A280为1.9～2.0,若样品中存在严重污染,则A260/A280的比值要低,就不能通过分光光度法进行精确定量。1.1RNA提取的步骤1.4RNA提取中的注意事项(1)匀浆处理。组织:称取一定量的新鲜组织在液氮中充分研磨,这高质量的RNA是进行基因克隆、基因表达研究等的前提,但由于个过程要迅速,并且使组织保持冰冻状态。悬浮生长的细胞:将细胞离RNA很容易被RNase降解,并且RNase广泛存在且很难变性失活,RNA心,吸出培养液,用无菌冰冷的PBS(磷酸缓
5、冲液)洗涤细胞,并离心收集提取的主要问题是尽可能地防止RNase的污染。因此,RNA提取中必须细胞,吸去PBS。单层培养细胞:吸出培养液,用无菌冰冷的PBS洗涤细注意以下事项:胞,吸去PBS。将上述处理的组织或细胞中加入裂解液,于室温用匀浆器(1)RNA操作区应保持清洁,并定期进行除菌;离心机、自动移液器、高速匀浆。试剂等应专用。(2)将匀浆物温育5min,使核蛋白复合物完全解离。(2)用于RNA实验的玻璃器皿、塑料制品等应为专用。(3)在每毫升裂解液中加入0.2mL氯仿,剧烈振荡以充分混匀样品。(3)操作过程中应戴口罩和一次性橡胶手套,并经常更换,以防止(4)将混合物于
6、4℃以12000r/min离心15min,使混合物分为两手、臂上的细菌和真菌以及RNase带到试管或污染用具。相,DNA和蛋白质被抽提进有机相,RNA留在水相。将上层水相转移到(4)避免在操作中说话聊天,防止RNase污染。一个新的离心管中。(5)尽量使用一次性的塑料制品,避免共用器具,如tips,tubes等,以(5)在水相中加入异丙醇和RNA沉淀液,充分混匀后,室温放置20防止产生交叉污染,导致实验失败。min～30min,沉淀RNA。(6)配制溶液用的酒精、异丙醇等应采用未开封的新瓶。溶液需用(6)于4℃以12000r/min离心15min,去上清,收集RNA沉淀。
7、DEPC水配制(加0.1%DEPC至重蒸水或MiliQ级水中,过夜处理,灭菌(7)用75%的乙醇洗涤沉淀两次,重复上述离心过程。即为DEPC水)。(8)室温放置,让乙醇挥发殆尽。但不要让RNA沉淀完全干透,因为(7)所有玻璃制品、塑料制品都必须用0.1%的DEPC水浸泡过夜,然RNA完全干燥后会很难溶解。后灭菌,180℃烘干。(9)加入50μL～100μL的无RNase的水,反复吹打混匀,充分溶解(8)无法用DEPC处理的用具可用氯仿擦拭若干次,这样通常可以RNA。消除RNase的活性。但氯仿会溶解某些塑料制品,应当注意。(1
