RNA提取步骤详细解析.doc

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1、RNA抽提详细解析  1、RNA抽提原理  简单地讲，RNA抽提包含样品的裂解和纯化两大步骤。裂解是使样品中的RNA游离在裂解体系中的过程，纯化则是使RNA与裂解体系中的其它成分，如DNA、蛋白质、盐及其它杂质彻底分离的过程。Trizol试剂的出现基本能解决绝大部分样品RNA抽提，该方法已经成为了 RNA 抽提的主流。    2、了解你的实验样品 如果你研究某个实验样品，并且要抽提它的RNA，以下的信息一定要先行收集：该样品的RNA含量、酶含量、特殊杂质含量。如果你对样品的特点一无所知，当样品稍微有一点复杂时，抽提RNA的实验就会碰到许多问题。以血液为例，如果你不知道鸟的血液中有核细胞

2、的含量是人血的千倍左右，而使用人血一样的起始量去抽提鸟血的基因组DNA，怎么可能成功？失败了又怎么知道原因所在？同时，只有对实验样品有所了解，才能正确选择抽提方法。但同时提醒的是：没有信息是可怕的，更可怕的是将错误的信息当真的了。  3、实验样品量的取用  样品与Trizol的比例。这个问题非常重要，应该获得足够的重视。Trizol的Protocol，提供了一个简单的比例，1ml裂解液可以用于50-100mg组织或5-10X106个细胞；我的建议是，样品量绝对要小于资料所提供的。起始样品用多大，并没有具体的说法。如果不是样品量有限，则以能抽提出满足数次成功实验所需的RNA，作为决定样品

3、起始量的基础，会比较合理的。不要因为1ml裂解液可以抽提 100mg 样品，就一定使用 100mg 样品。裂解液的用量，表面上与抽提的结果 (纯度及得率) 没有关系，然而，在实际操作中，对结果是有比较大的影响的。裂解液的用量原则是：确保能彻底裂解样品，同时使裂解体系中核酸的浓度适中。浓度过低，将导致沉淀效率低，影响得率；浓度过高，去除杂质的过程复杂且不彻底，导致纯度下降。不同得样品其RNA含量差别很大。高丰度(2-4ug/mg)的如肝脏，胰腺，心脏，中丰度(0.05-2ug/mg)的如脑，胚胎，肾脏，肺，胸腺，卵巢，低丰度(<0.05ug/mg)的如膀胱，骨，脂肪。考虑后续实验，一般情

4、况下，高丰度的样品取用量大概是10-20mg/ml Trizol,中丰度样50mg/ml Trizol,低丰度样品我们可以根据客户提供的实验样品量酌情取用。重申一下，不是越多越好，在考虑样品在1mlTrizol里能充分裂解的同时，还得考虑大量的样品可能也会带来大量的杂质！利用Trizol试剂抽提血清样品时，Trizol /血清比值不要小于7/3。石蜡样品由于RNA降解严重，含量大打折扣，所以取样时应该按低丰度样品原则取用。  4、裂解方法  裂解的目的就是破坏细胞的结构，释放出里面的RNA，使其溶解于裂解液中。绝大部分样品的裂解，比如冻存的细胞，心、肝、脾、肺、肾等，利用Trizol试

5、剂，普通的匀浆方法就可以达到满意的效果！但是如果碰到比较特殊的样品，我们可能要附加一些其他的辅助手段。1）骨骼。骨骼组织质地坚硬，普通的匀浆器根本无法使其破碎，以致RNA不能完全释放溶解在TRIZOL试剂中，碰到这种类型的样品，我们必须先利用液氮把样品破碎成粉末状，Trizol悬浮混匀再利用Minibeadbeater匀浆5分钟。取上清, 2000g  4℃离心5min再取上清 去沉淀。2）细菌  Trizol虽然对细胞的裂解效果出众，但是对细菌坚韧的细胞壁还是无可奈何，这时我们可以利用超声来辅助破壁。将细菌重悬于300ul的Trizol中，置于Bioruptor冰水浴中，M档30s“

6、on”、30“off”超声处理1—2 min.取出用Trizol将体积补至1ml。3)酵母 酵母细胞跟细菌一样，还是因为细胞壁的原因，不能充分裂解。Zymolyase在37℃ 40分钟可以很好的消化掉酵母细胞壁，这里需要提醒的是消化缓冲液不能有外源性RNA酶污染，最好附加使用RNA酶抑制剂，做好了这点就不用担心这步有RNA降解的问题。4）石蜡包埋样品 石蜡包埋的组织样品在加Trizol裂解前必须先脱蜡，脱蜡的效果直接影响后续实验，所以我们为使脱蜡充分，选用高温脱蜡与二甲苯脱蜡相结合的两步脱蜡法。脱蜡后加入Trizol匀浆。5）脂肪 脂肪组织可以直接用Trizol 匀浆，这里需要提醒的是

7、脂肪组织匀浆后，需室温静置5min，再室温7500g离心5分钟，去除上面的脂肪层再继续后续实验！   5、分相  Trizol里含有的物质之一“酚”去除蛋白质是有一定的饱和度的。超过了该饱和度，裂解体系中的蛋白质不会被一次去除，裂解匀浆后的样品，按1ml Trizol 加200ul 的氯仿，震荡离心，绝大部分样品在这一步是不需要用特殊方法对待的，但对于蛋白含量比较高的组织样品必须要二次抽提，甚至多次抽提方可彻底去除。这里要着重提到的是血清样品！