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时间:2020-07-23
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1、RNA抽提详细解析 1、RNA抽提原理 简单地讲,RNA抽提包含样品的裂解和纯化两大步骤。裂解是使样品中的RNA游离在裂解体系中的过程,纯化则是使RNA与裂解体系中的其它成分,如DNA、蛋白质、盐及其它杂质彻底分离的过程。Trizol试剂的出现基本能解决绝大部分样品RNA抽提,该方法已经成为了 RNA 抽提的主流。 2、了解你的实验样品 如果你研究某个实验样品,并且要抽提它的RNA,以下的信息一定要先行收集:该样品的RNA含量、酶含量、特殊杂质含量。如果你对样品的特点一无所知,当样品稍微有一点复杂时,抽提RNA的实验就会碰到许多问题。以血液为例,如果你不知道鸟的血液中有核细胞
2、的含量是人血的千倍左右,而使用人血一样的起始量去抽提鸟血的基因组DNA,怎么可能成功?失败了又怎么知道原因所在?同时,只有对实验样品有所了解,才能正确选择抽提方法。但同时提醒的是:没有信息是可怕的,更可怕的是将错误的信息当真的了。 3、实验样品量的取用 样品与Trizol的比例。这个问题非常重要,应该获得足够的重视。Trizol的Protocol,提供了一个简单的比例,1ml裂解液可以用于50-100mg组织或5-10X106个细胞;我的建议是,样品量绝对要小于资料所提供的。起始样品用多大,并没有具体的说法。如果不是样品量有限,则以能抽提出满足数次成功实验所需的RNA,作为决定样品
3、起始量的基础,会比较合理的。不要因为1ml裂解液可以抽提 100mg 样品,就一定使用 100mg 样品。裂解液的用量,表面上与抽提的结果 (纯度及得率) 没有关系,然而,在实际操作中,对结果是有比较大的影响的。裂解液的用量原则是:确保能彻底裂解样品,同时使裂解体系中核酸的浓度适中。浓度过低,将导致沉淀效率低,影响得率;浓度过高,去除杂质的过程复杂且不彻底,导致纯度下降。不同得样品其RNA含量差别很大。高丰度(2-4ug/mg)的如肝脏,胰腺,心脏,中丰度(0.05-2ug/mg)的如脑,胚胎,肾脏,肺,胸腺,卵巢,低丰度(<0.05ug/mg)的如膀胱,骨,脂肪。考虑后续实验,一般情
4、况下,高丰度的样品取用量大概是10-20mg/ml Trizol,中丰度样50mg/ml Trizol,低丰度样品我们可以根据客户提供的实验样品量酌情取用。重申一下,不是越多越好,在考虑样品在1mlTrizol里能充分裂解的同时,还得考虑大量的样品可能也会带来大量的杂质!利用Trizol试剂抽提血清样品时,Trizol /血清比值不要小于7/3。石蜡样品由于RNA降解严重,含量大打折扣,所以取样时应该按低丰度样品原则取用。 4、裂解方法 裂解的目的就是破坏细胞的结构,释放出里面的RNA,使其溶解于裂解液中。绝大部分样品的裂解,比如冻存的细胞,心、肝、脾、肺、肾等,利用Trizol试
5、剂,普通的匀浆方法就可以达到满意的效果!但是如果碰到比较特殊的样品,我们可能要附加一些其他的辅助手段。1)骨骼。骨骼组织质地坚硬,普通的匀浆器根本无法使其破碎,以致RNA不能完全释放溶解在TRIZOL试剂中,碰到这种类型的样品,我们必须先利用液氮把样品破碎成粉末状,Trizol悬浮混匀再利用Minibeadbeater匀浆5分钟。取上清, 2000g 4℃离心5min再取上清 去沉淀。2)细菌 Trizol虽然对细胞的裂解效果出众,但是对细菌坚韧的细胞壁还是无可奈何,这时我们可以利用超声来辅助破壁。将细菌重悬于300ul的Trizol中,置于Bioruptor冰水浴中,M档30s“
6、on”、30“off”超声处理1—2 min.取出用Trizol将体积补至1ml。3)酵母 酵母细胞跟细菌一样,还是因为细胞壁的原因,不能充分裂解。Zymolyase在37℃ 40分钟可以很好的消化掉酵母细胞壁,这里需要提醒的是消化缓冲液不能有外源性RNA酶污染,最好附加使用RNA酶抑制剂,做好了这点就不用担心这步有RNA降解的问题。4)石蜡包埋样品 石蜡包埋的组织样品在加Trizol裂解前必须先脱蜡,脱蜡的效果直接影响后续实验,所以我们为使脱蜡充分,选用高温脱蜡与二甲苯脱蜡相结合的两步脱蜡法。脱蜡后加入Trizol匀浆。5)脂肪 脂肪组织可以直接用Trizol 匀浆,这里需要提醒的是
7、脂肪组织匀浆后,需室温静置5min,再室温7500g离心5分钟,去除上面的脂肪层再继续后续实验! 5、分相 Trizol里含有的物质之一“酚”去除蛋白质是有一定的饱和度的。超过了该饱和度,裂解体系中的蛋白质不会被一次去除,裂解匀浆后的样品,按1ml Trizol 加200ul 的氯仿,震荡离心,绝大部分样品在这一步是不需要用特殊方法对待的,但对于蛋白含量比较高的组织样品必须要二次抽提,甚至多次抽提方可彻底去除。这里要着重提到的是血清样品!
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