液氮研磨提取组织RNA步骤

《液氮研磨提取组织RNA步骤》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、液氮研磨组织提取RNA步骤一、试剂与耗材（RNA提取专用，无RNase）75%的酒精（用无酶水配制），RNaseZap，Trizol(Invitrogen)，氯仿，异丙醇，无RNA酶水（Ambion）；研钵，研杵，1.5mlEP管，2.0mlEP管，15ml管，50ml管，棉纱布。二、操作步骤1)用75%酒精对实验操作台、移液枪、枪头盒、管架进行消毒，然后再用RNaseZap擦拭上述材料。2)取出-80℃冰箱保存的组织块，放于用液氮预冷过的研钵中，敲碎一小块组织，其余放回冻存管。3)加入液氮，先轻轻敲碎组织到最小块

2、，再研磨成粉末，直到看不到组织块。4)加入液氮使粉末凝聚成团，马上用药勺把粉末转移到2.0mlEP管中。5)待液氮挥发干后，加入1mlTrizol裂解液，用1ml移液器将细胞吹散开，保证细胞裂解充分，必要时可借助水平振荡器混匀。6)4℃离心机12000rpm离心5分钟,弃沉淀。注：此时可放入-80℃低温冰箱长期保存。7)加入氯仿，比例200ul氯仿/mlTrizol，颠倒混匀，室温放置15分钟。1)于4℃离心机12000g离心15分钟。取上清液（上层为水相，中间层为蛋白，下层为有机相，核酸分子主要集中在上层），注意

3、吸取上清是无触碰到中间层或下层。2)取上清液（上层为水相，中间层为蛋白，下层为有机相，核酸分子主要集中在上层），注意吸取上清是无触碰到中间层或下层。3)加入等体积异丙醇，-20℃沉淀1小时。4)于4℃离心机12000g离心10分钟。5)弃上清，加入1ml75%酒精漂洗沉淀，于4℃离心机800g离心5分钟。必要时可重复酒精洗涤6)弃上清，可选择再次离心去除残留的乙醇，沉淀在安全柜内晾干，切忌过干，只需目测乙醇挥发干即可。7)根据沉淀的大小，使用无RNA酶的水将RNA沉淀充分溶解。选择溶解沉淀的体积，一般为30-100

4、ul。测RNA浓度，此方法RNAA260/A280值在1.6-1.8之间。8)电泳检测RNA完整性，0.5XTBEBuffer,110V电泳30分钟。9)最后将沉淀保存在-80℃低温冰箱。