牛肠道病毒 RT -PCR 检测方法的建立及初步应用-论文.pdf

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1、山东农业科学2014，46(2)：13～16ShandongAgriculturalSciences牛肠道病毒RT—PCR检测方法的建立及初步应用侯佩莉，程洪兵，刘晓，王洪梅，何洪彬(山东省农业科学院奶牛研究中心，山东济南250100)摘要：参照GenBank中登录的牛肠道病毒(BEV)全基因组序列，针对其3D基因设计合成了1对特异性引物，提取病毒RNA，逆转录为cDNA，进行PCR扩增，经条件优化，建立了BEV的RT—PCR检测方法，并对该方法的特异性、敏感性进行验证。结果显示，该方法从分离的牛肠道病毒中扩增出了732bp的特异性目的片段；且对牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)

2、、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛轮状病毒(BRV)、牛冠状病毒(BCoV)等相关病毒均无交叉反应；其检出敏感度达10-，1TCID应用该方法对山东地区84份临床疑似发病牛样品进行检测，21份为阳性，阳性检出率为25％。关键词：牛肠道病毒；3D基因；RT—PCR；检测中图分类号：$852．653文献标识号：A文章编号：1001—4942(2014)02—0013—04EstablishmentandApplicationofRT——PCRforDetectionofBovineEnterovirusHouPeili，ChengHongbing，LiuXiao，WangHongm

3、ei，HeHongbin(DairyCattleResearchCenter，ShandongAcademyofAgriculturalSciences，Jinan250100，China)AbstractAreversetranscriptionPCR(RT—PCR)methodfordetectionofbovineenterovirus(BEV)wasestablishedusingapairofspecificprimersdesignedbasedonthe3DgeneofBEVinGenBank．Thismethodcouldspecificallyamplifya

4、732一bpfragmentfromBEVstrain，butnotfrombovineviraldiarrheavi-rus(BVDV)，infectiousbovinerhinotracheitisvirus(IBRV)，bovinecoronavirus(BCoV)andbovinerota—virusvirus(BRV)．Thedetectionlimitofthismethodwas10～TCID50ofBEV．Inadetectionof84samplessuspectedwithbovinedisease，21sampleswerepositivewiththep

5、ositiverateas25％．KeywordsBovineenterovirus；3Dgene；RT—PCR；Detection牛肠道病毒(Bovineenterovirus，BEV)属于小据研究报道，牛肠道病毒在国外牛群中的阳RNA病毒科、肠道病毒属，呈球形，大小为25～30性率约为17．6％～80％，而在我国，有关此病nm，是无囊膜单股正链RNA病毒⋯。自1959年的病原学及流行病学调查的报道很少。近年来，Moll和Davis首次分离到BEV以来，很多国家山东省周边某些牛场发生了以水样和血便等严重和地区先后报道了牛肠道病毒的感染情况_3J。腹泻为特征的疾病，致使奶牛的食

6、欲和产奶量大肠道病毒是脊椎动物肠道中原有的栖居者，可以幅下降。本研究结合本实验室分离获得的牛肠道从患肠道疾病、肺炎、呼吸系统疾病和生殖障碍疾病毒基因和GenBank登录的牛肠道病毒全基因病的牛分泌物或排泄物中分离获得，也可以从正组序列，针对其3D基因的相对保守区域，设计1常牛的粪便样品中分离，还存在于牛粪便污染的对特异性引物，建立了牛肠道病毒的RT—PCR检环境或水体中，常作为粪便污染指示剂]。测方法，并初步应用于临床送检样本的检测，具有收稿日期：2013—11—29；修回日期：2013—12—03基金项目：现代农业(奶牛)产业技术体系科学家岗位基金(Cars一37)；泰山学者

7、海外特聘专家基金(tshw20100417)；国家自然科学基金(31072160)；济南留学人员创业计划(20120203)；山东省农业重大应用技术创新课题作者简介：侯佩莉(1985一)，女，山东省费县人，硕士，主要研究方向为预防兽医学。E～mail：apeilihou@163．com通讯作者：何洪彬(1967一)，男，博士，主要从事奶牛疾病防控及转基因研究。E—mail：hongbinh@hotmail．com14山东农业科学第46卷较好的敏感性和特异性，为国内牛肠道病毒的临条件(变性、退