树鼩呼肠孤病毒RT-nPCR检测方法的建立及初步应用-论文.pdf

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1、2014年6月中国比较医学杂志June，2014第24卷第6期CHINESEJOURNALOFCOMPARATIVEMEDICINEV0l_24NO．6树胸呼肠孤病毒RT—nPCR检测方法的建立及初步应用李晓飞，殷安国，张媛，罗军，孙晓梅，代解杰(中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所树嗣种质资源中心，云南省重大传染病疫苗研发重点实验室，昆明650118)【摘要】目的建立树嗣呼肠孤病毒(TRV)RT．nPCR检测方法，为树购的质量控制提供检测方法。方法从三批野外来源的具有感染临床症状的树鼠句粪便中分离得到三株病毒，经电镜观察和聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定为哺乳动物呼肠孤

2、病毒(MRV)。根据GenBank中已发表的MRVL1基因的保守区域，设计合成巢式引物，对所分离的三株树鼢呼肠孤病毒(TRV1、TRV2、TRV3)的RNA进行RT—nPCR扩增，优化反应条件，进行特异性、敏感性试验。应用RT-nPCR方法对25只野外来源的相同症状疑似病例样本进行检测。结果针对分离到的三株树胸呼肠孤病毒的RNA进行RT—nPCR扩增，均得到513bp的特异性目的片段，培养细胞及甲肝病毒、轮状病毒、单纯疱疹病毒阴性对照均未扩增出条带。敏感性试验结果显示可检测到的最小RNA模板浓度为0．O1pg／L。25只树嗣粪便样本经RT-nPCR检测，有14只TRV阳

3、性，其中死亡动物组1O只，检出率为100％；存活动物组l5只，检出率为27％。结论建立的TRVRT—nPCR检测方法特异、敏感、稳定，可用于TRV的常规检测。【关键词】树嗣；哺乳动物呼肠孤病毒；反转录巢式聚合酶链式反应；巢式引物【中图分类号】R33【文献标识码】A【文章编号】1671—7856(2014)06—0063—06doi：10．3969．j．issn．1671．7856．2014．006．014一EstablishmentandapplicationofaRT-nPCRassayfor，c技detection0f0rth0reOvirusintreeshrew

4、s术Ic方法LIXiao—fei，YINAn—guo，ZHANGYuan，LUOJun，SUNXiao—mei，DAIJie—jie(CenterofTreeShrewsGermplasmResources，InstituteofMedicalBiology，ChineseAcademyofMedicalSciencesandPekingUnionMedicalCollege．YunnanKeyLaboratoryofVaccineResearch&DevelopmentOnSevereInfectionDiseases，Kunming650118，China)【Abs

5、tract】ObjectiveToestablishareversetranscriptionnestedpolymerasechainreaction(RT—nPCR)assayfordetectionoftreeshrewsorthoreovirus(TRV)．MethodsThreestrainsofTRVwererespectivelyisolatedfromfreshfecesofthreetreeshrewsthatcamefromthesamefieldatdifferenttimes．WedesignedandsynthesizedtwopairsofM

6、RVL1genenestedprimersandestablishedthesystemofRT—nPCR．TheTRVRNAwasextractedandreverselytranscribedtocDNAasatemplatefornested—PCRamplification．ThedevelopedRT—nPCRwasoptimized．Thespecificityandsensitivityweretested．Finally，theRT—nPCRwasusedtodetectTRVin25treeshrewsamples．ResultsTakingthege

7、nomicRNAofTRVastemplate，theRT—nPCRwasabletoamplifyaspecificfragmentbandtargetingtheL1gene，whiletherewereno[基金项目]国家科技支撑计划(2011BAII5B01—21；20l2BAI39B0l；2014BA101B01)，云南省科技创新平台建设(2013DA002)[作者简介]李晓飞(1988一)，女，硕士，研究方向：实验动物病毒学。[通讯作者]孙晓梅(1963一)，女，主任技师，E-mail：sxm@imbcams．com．cn；代