青蟹呼肠孤病毒和青蟹双顺反子病毒-1双重巢式PCR检测方法的建立-论文.pdf

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1、中国水产科学2013年7月，20(4)：808—815JournalofFisherySciencesofChina研究论文DoI：l0．3724／SP．J．1118．2013．00808青蟹呼肠孤病毒和青蟹双顺反子病毒．1双重巢式PCR检测方法的建立张迪一，杨铿，苏友禄，冯娟，郭志勋1．中国水产科学研究院南海水产研究所农业部水产品加工重点实验室，农业部南海渔业资源开发利用重点实验室，广东广州510300；2．上海海洋大学水产与生命学院，上海201306摘要：青蟹呼肠孤病毒(mudcrabreovirus，MCRV)和

2、青蟹双顺反子病毒一l(mudcrabdicistrovirus一1，MCDV1)是从近年发生大规模死亡的养殖拟穴青蟹体内分离的、对青蟹具有致病性的两种病毒。它们常常同时存在，给青蟹养殖业带来巨大经济损失。在疾病的防治中，快速高效的病毒检测方法对疾病诊断以及及时采取有效地防治措施具有重要的意义。本研究利用MCRV和MCDV-1基因保守区设计4对引物，建立了可同时检测这两种病毒的双重巢式PCR(duplex．nestedPCR)检测方法。研究发现该方法对两种病毒的检测限都可以达到l0个拷贝，并与鲍肌肉萎缩病毒(AbSV)、

3、虾类传染性表皮与造血组织坏死症病毒(IHHNV)、大菱鲆红体病虹彩病毒(TRBIV)、对虾白斑综合症病毒(wssv)、鱼类神经坏死病毒(NNV)和贝类急性病毒性坏死症病毒(AVNV)等水生动物常见病毒均无交叉反应，可以特异性地检测两种病毒。本方法具有高灵敏度、高特异性和简便快捷等特点，可作为一种快速诊断工具，检测拟穴青蟹中的MCRV和MCDV-1基因。关键词：拟穴青蟹：青蟹呼肠孤病毒；青蟹双顺反子病毒．1；双重巢式PCR中图分类号：$945文献标志码：A文章编号：1005—8737一(2013)04—0808—08拟穴

4、青蟹(Scylla口，0口)(原被鉴定为rus．1，MCDV-1)J，2012年被国际病毒分类委员锯缘青蟹(Scyllaserrata)¨)是中国东南沿海地区会(InternationalCommitteeonTaxonomyofVi—重要的海水养殖种类，2010年全国总产量达到了ruses，ICTV)~E式命名为青蟹病毒(MudCrabVi—l1．6万t【2]。但随着养殖规模的逐步扩大，不良环rus)刚。人工感染这两种病毒的青蟹死亡率均达境因子、细菌、寄生虫、病毒等因素导致青蟹病到100％L5，9]0“嗜睡病”流行性

5、广、导致的死亡率高、害问题不断严重LjJ。危害严重，极大地限制了拟穴青蟹养殖业的发展。2004年开始在福建、广东等多个省份发生的目前已报道的MCRV检测方法有巢式逆转录养殖青蟹“嗜睡病”，死亡率接近70％【4】。从患“嗜PcR(nR_T-PCR)法u、反转录环介导等温扩增技术睡病”的青蟹中分离到两种病原：一种是青蟹呼(reversetranscriptionloop—mediatedisothermalampli—肠孤病毒(mudcrabreovirus，MCRV)J，亦称锯缘ficationassay,RT-LAMP

6、)[121等。这两种方法检出青蟹呼肠孤病毒(Scyllaserratareovirus，SsRV)；结果准确可靠，但只能检测一种病原，在混合感另一种是青蟹双顺反子病毒(mudcrabdicistrovi—染检测中存在一定的局限性。因此，建立快速、收稿日期：2012—12-07；修订日期：2013—03—09．基金项目：广东省科技计划项目(2011A020102002)；广东省海洋渔业科技推广专项(A201001H04)；广东省教育部产学研结合项目(2010B090400519)；中国水产科学研究院基本科研业务费资助(2

7、012TS06)．作者简介：张迪(1987一)，女，硕士研究生，主要从事青蟹养殖病害研究．E-mail：zhangdil5@yahoo．tom．cn通信作者：郭志勋，研究员．E—mail：guozhixul@163．tom第4期张迪等：青蟹呼肠孤病毒和青蟹双顺反子病毒．1双重巢式PCR检测方法的建立813注：“”指未进行该检测．一一Note：“”representsthedetectionwasnotperformed一一有效平衡了每个基因的扩增效率，使之趋于相同。参考文献：多重PCR体系因受影响因素较多，敏感性从【1

8、】林琪，李少菁，黎中宝，等．中国东南沿海青蟹属(Scylla)l0～10copies[。的情况都存在，而巢式PCR的的种类组成[J]．水产学报，2007，31(2)：211-219．灵敏度以第二轮扩增为准，通常在10～10cop—[2]中国农业部渔业局．2011年中国渔业年鉴[M]．北京：中国农业出版社，2011：180．ies[