猫杯状病毒与猫疱疹病毒双重巢氏RT-PCR检测方法.pdf

《猫杯状病毒与猫疱疹病毒双重巢氏RT-PCR检测方法.pdf》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、ICS11.220B41团体标准T/CVMAX1—2019猫杯状病毒与猫疱疹病毒双重巢氏RT-PCR检测方法RapidDetectionofFelineCalicivirusandFelineHerpesvirusbyDuplexNestedRT-PCR(征求意见稿)中国兽医协会CVMA2019-xx-xx发布2019-xx-xx实施中国兽医协会发布T/CVMAX1—2019前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准不涉及专利。本标准由中国兽医协会提出并归口。本标准起草单位：吉林农业大学,吉林省野生动物救护繁育中心。本标准主要起草人：王开、胡桂学

2、、伊淑帅、裴志花、王海军、牛江婷、董浩、赵艳丽。CVMA中国兽医协会IT/CVMAX1—2019猫杯状病毒与猫疱疹病毒双重巢氏RT-PCR检测方法1范围本标准规定了猫杯状病毒与猫疱疹病毒双重巢氏RT-PCR检测方法的缩略语、材料、操作步骤和结果判定。本标准适用于猫、老虎等猫科动物的杯状病毒与疱疹病毒的实验室诊断。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法。3缩略语下列缩略语适用于本文件。RT

3、–PCR：逆转录-聚合酶链反应（Reversetranscription-polymerasechainreaction）。RNA：核糖核酸（Ribonucleicacid）。cDNA：互补脱氧核糖核酸（complementaryDNA）。4材料4.1仪器设备4.1.1分析天平，感量0.1mg。4.1.2高速冷冻离心机，12000r/min以上。4.1.3高压蒸汽灭菌器。4.1.4干热箱。CVMA4.1.5恒温水浴锅，控温范围为室温至100℃。4.1.6中国兽医协会冰箱，-20℃。4.1.7PCR扩增仪。4.1.8凝胶成像系统。4.2器械与耗材4.2.1医用棉签。

4、4.2.2离心管，1.5mL，15mL，50mL。4.2.30.22μm过滤器。4.2.4移液器，0.1-2.5μL，0.5-10μL，1-100μL，100-1000μL。4.2.5枪头，10μL，200μL，1000μL。4.3试剂2T/CVMAX1—2019除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯，实验用水应符合GB/T6682中一级水的要求。4.3.1RNA提取试剂盒。4.3.2反转录试剂盒。4.3.3灭菌双蒸水。4.4引物4.4.1试验中所用引物见表1。表1引物序列和片段大小病毒引物名称引物序列片段大小CaliAF5’-CAACCTGCGCTAACGTG

5、CTTA-3’681bpCaliAR5’-TTCCCCCAAAAACYCCAGATC-3’猫杯状病毒CaliBF5’-CACTCAYGAGGCCATYGAC-3’336bpCaliBR5’-TTCCCTTGGGTTTCAGATGTGC-3’HerpAF5’-AGATTTGCCGCACCATACCTTC-3’513bpHerpAR5’-CCGGGCTTTGAAAACACTGAAT-3’猫疱疹病毒HerpBF5’-TTGCCGCACCATACCTTCTTTTA-3’403bpHerpBR5’-TTAAGCTTCCCCCACCCATCA-3’5操作步骤5.1采样器具前处

6、理5.1.1医用棉签经121±2℃高压蒸汽灭菌15min。5.1.2离心管、枪头经121℃±2℃高压蒸汽灭菌15min。5.2样品的采集和处理采集宠物猫的口腔或鼻腔分泌物，加入样品10%体积的PBS稀释，过0.22μm过滤器，收集滤液，8000g离心10min，取上清液待检。CVMA5.3RNA中国兽医协会提取使用RNA提取试剂盒提取样品RNA后，利用反转录试剂盒进行反转录，以提取的cDNA为模板进行巢式PCR扩增，或置于-20℃冰箱备用。5.4反应体系5.4.1猫杯状病毒与猫疱疹病毒外侧引物双重PCR反应体系见表2。3T/CVMAX1—2019表2双重巢式RT-

7、PCR第1轮反应体系试剂名称加入量10×rTaqbuffer2.5μLdNTPs7.5mMrTaq3.0UCaliAF10pMCaliAR10pMHerpAF10pMHerpAR10pMcDNA模板3μl双蒸水19.5μl5.4.2猫杯状病毒与猫疱疹病毒内侧引物双重PCR反应体系见表3。表3双重巢式RT-PCR第2轮反应体系试剂名称加入量10×rTaqbuffer2.5μLdNTPs7.5mMrTaq3.0UCaliBF10pMCaliBR10pMHerpBF10pMHerpBR10pM用外侧引物进行PCR的产物2.0μl双蒸水20.5μl5.4.3以去离子水（D

8、W）为阴性