DB22T 3111-2020 猫杯状病毒检测 实时荧光RT-PCR法.pdf

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1、ICS11.220B41DB22吉林省地方标准本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T3111—2020猫杯状病毒检测实时荧光RT-PCR法DetectionmethodofrealtimequantitativeRT-PCRforFelinecalicivirus本标准仅供内部使用不得翻印2020-03-16发布2020-03-30实施吉林省市场监督管理厅发布本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T3111—2020本标准仅供内部使用不得翻印前言本标准按照GB/T1.1-

2、2009和GB/T20001.4-2015给出的规则起草。本标准由吉林省畜牧业管理局提出并归口。本标准起草单位：吉林农业大学、吉林省畜牧兽医科学研究院。本标准主要起草人：胡桂学、王开、郭衍冰、姜雪、黄海龙、呼延含蓉、赵艳丽、程荣华、伊淑帅、牛江婷。本标准仅供内部使用不得翻印I本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T3111—2020本标准仅供内部使用不得翻印猫杯状病毒检测实时荧光RT-PCR法1范围本标准规定了猫杯状病毒实时荧光RT-PCR检测方法的试剂和材料、仪器设备、

3、样品、试验步骤、结果判定和废弃物处理的技术要求。本标准适用于猫杯状病毒核酸的检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求GB/T27401实验室质量控制规范动物检疫3缩略语本标准仅供内部使用不得翻印下列缩略语适用于本文件。Ct循环阈值（Cyclethreshold）Cdna互补脱氧核

4、糖核酸（ComplementaryDeoxyribonucleicacid）DMEM改良Eagle培养基（Dulbecco'smodificationofEagle'smedium）ORF开放阅读框（OpenReadingFrame）RNA核糖核酸（Ribonucleicacid）RT-PCR反转录聚合酶链式反应（Reversetranscriptionpolymerasechainreaction）4原理根据猫杯状病毒衣壳蛋白ORF2的保守区基因序列，设计引物和探针。探针在5’端标记FAM荧光

5、素作为报告荧光基团，3’端标记Eclipse作为淬灭荧光基团。反应进入退火阶段时，引物和探针同时与目的基因片段结合，此时探针上荧光基团发出的荧光信号被淬灭基团所吸收，仪器检测不到荧光信号；反应进入延伸阶段时，Taq酶发挥5’→3’的外切核酸酶功能，将探针降解。探针上的荧光基团游离出来，所发出的荧光不再为淬灭基团所吸收而被检测仪所接收。随着PCR反应的循环往复，PCR产物呈指数形式增长，荧光信号也相应增长。每个模板的Ct值与该模板起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。5试剂和材

6、料5.1试剂1DB22/T3111—2020除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯。实验用水应符合GB/T6682中一级水的要求。5.1.1DMEM培养液。5.1.2液氮。本标准仅供内部使用不得翻印5.1.3RNA提取试剂盒。5.1.4反转录试剂盒。5.1.5阳性对照，为猫杯状病毒的细胞培养物或非感染性体外转录RNA。5.1.6阴性对照，为不含猫杯状病毒的细胞培养液。5.1.7无RNA酶的水（Rnasefreewater）。5.1.8Taq酶。5.2材料5.2.1无菌拭子。5.2.2离心管，1

7、.5mL、15mL和50mL。5.2.3吸头，200μL～1000μL、20μL～200μL、2μL～20μL和0.5μL～10μL。5.2.4无RNA酶吸头，200μL～1000μL、20μL～200μL、2μL～20μL和0.5μL～10μL。5.2.5无RNA酶离心管，0.2mL和1.5mL。5.2.6研钵。5.2.7荧光定量PCR反应管,根据荧光PCR仪要求选择单管、八连排管或96孔荧光反应板。5.3引物和探针本标准仅供内部使用不得翻印引物及探针使用时配制成表1中浓度，置-20℃保存，6

8、个月内使用。表1引物序列和浓度序列浓度引物和探针名称5’―3’μmol/L上游引物FCTGACTTCAAATTTCATCTC0.20下游引物RTGGGAATTAAGTCAGAGG0.20探针(FAM)ATCTATGCTCACTCATGGATCTGTC(Eclipse)0.406仪器设备6.1冰箱，-20±2℃，-80±2℃。6.2高速冷冻离心机，12000r/min以上。6.3可调移液器，200μL～1000μL、20μL～200μL、2μL～20μL和0.5μL～10μL。6.4天平，感量0.