DB22T 3111-2020 猫杯状病毒检测 实时荧光RT-PCR法.pdf

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1、ICS11.220B41DB22吉林省地方标准DB22/T3111—2020猫杯状病毒检测实时荧光RT-PCR法DetectionmethodofrealtimequantitativeRT-PCRforFelinecalicivirus2020-03-16发布2020-03-30实施吉林省市场监督管理厅发布DB22/T3111—2020前言本标准按照GB/T1.1-2009和GB/T20001.4-2015给出的规则起草。本标准由吉林省畜牧业管理局提出并归口。本标准起草单位：吉林农业大学、吉林省畜牧兽医科学研究院。本标准主要起草人：胡桂学、王开、郭衍冰、姜雪、黄

2、海龙、呼延含蓉、赵艳丽、程荣华、伊淑帅、牛江婷。IDB22/T3111—2020猫杯状病毒检测实时荧光RT-PCR法1范围本标准规定了猫杯状病毒实时荧光RT-PCR检测方法的试剂和材料、仪器设备、样品、试验步骤、结果判定和废弃物处理的技术要求。本标准适用于猫杯状病毒核酸的检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求GB/T27401实验室质量控制规范动

3、物检疫3缩略语下列缩略语适用于本文件。Ct循环阈值（Cyclethreshold）Cdna互补脱氧核糖核酸（ComplementaryDeoxyribonucleicacid）DMEM改良Eagle培养基（Dulbecco'smodificationofEagle'smedium）ORF开放阅读框（OpenReadingFrame）RNA核糖核酸（Ribonucleicacid）RT-PCR反转录聚合酶链式反应（Reversetranscriptionpolymerasechainreaction）4原理根据猫杯状病毒衣壳蛋白ORF2的保守区基因序列，设计引物和探

4、针。探针在5’端标记FAM荧光素作为报告荧光基团，3’端标记Eclipse作为淬灭荧光基团。反应进入退火阶段时，引物和探针同时与目的基因片段结合，此时探针上荧光基团发出的荧光信号被淬灭基团所吸收，仪器检测不到荧光信号；反应进入延伸阶段时，Taq酶发挥5’→3’的外切核酸酶功能，将探针降解。探针上的荧光基团游离出来，所发出的荧光不再为淬灭基团所吸收而被检测仪所接收。随着PCR反应的循环往复，PCR产物呈指数形式增长，荧光信号也相应增长。每个模板的Ct值与该模板起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。5试剂和材料5.1试剂1DB22/T3111—20

5、20除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯。实验用水应符合GB/T6682中一级水的要求。5.1.1DMEM培养液。5.1.2液氮。5.1.3RNA提取试剂盒。5.1.4反转录试剂盒。5.1.5阳性对照，为猫杯状病毒的细胞培养物或非感染性体外转录RNA。5.1.6阴性对照，为不含猫杯状病毒的细胞培养液。5.1.7无RNA酶的水（Rnasefreewater）。5.1.8Taq酶。5.2材料5.2.1无菌拭子。5.2.2离心管，1.5mL、15mL和50mL。5.2.3吸头，200μL～1000μL、20μL～200μL、2μL～20μL和0.5μL～10μL。5

6、.2.4无RNA酶吸头，200μL～1000μL、20μL～200μL、2μL～20μL和0.5μL～10μL。5.2.5无RNA酶离心管，0.2mL和1.5mL。5.2.6研钵。5.2.7荧光定量PCR反应管,根据荧光PCR仪要求选择单管、八连排管或96孔荧光反应板。5.3引物和探针引物及探针使用时配制成表1中浓度，置-20℃保存，6个月内使用。表1引物序列和浓度序列浓度引物和探针名称5’―3’μmol/L上游引物FCTGACTTCAAATTTCATCTC0.20下游引物RTGGGAATTAAGTCAGAGG0.20探针(FAM)ATCTATGCTCACTCAT

7、GGATCTGTC(Eclipse)0.406仪器设备6.1冰箱，-20±2℃，-80±2℃。6.2高速冷冻离心机，12000r/min以上。6.3可调移液器，200μL～1000μL、20μL～200μL、2μL～20μL和0.5μL～10μL。6.4天平，感量0.01g。6.5恒温水浴锅，控温范围为室温至100℃。6.6荧光定量PCR扩增仪。7样品7.1样品的采集2DB22/T3111—20207.1.1将无菌拭子（5.2.1）在口腔和鼻腔内，刮取分泌物，将拭子插入离心管（5.2.2）中，加盖并标记，冷藏送检。7.1.2组织样品主要采集气管和肺脏，装入一次性塑

8、料袋或其他