纳豆生产优良菌株的筛选研究-论文.pdf

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安徽农业科学，JournalofAnhuiA．Sci．2012，40(22)：11415—11417责任编辑李菲菲责任校对卢瑶纳豆生产优良菌株的筛选研究张欣(中国食品发酵工业研究院，北京100027)摘要[目的]筛选出最优的纳豆生产菌株。[方法]以实验室现有的16株纳豆芽孢杆菌(Bacillusnatto)为出发菌株，通过蛋白酶、纳豆激酶及产黏(r—PGA)性能的综合指标，筛选出适合纳豆生产的纳豆芽孢杆菌。[结果]综合考虑，茵株DL一1521具有最高的蛋白酶、纳豆激酶和较高的产黏特性，具备作为纳豆生产优良菌种的特性。[结论]筛选结果可为纳豆直投式茵剂的制备提供优良菌株。关键词纳豆芽孢杆菌；纳豆激酶；产黏性能；筛选中图分类号S182文献标识码A文章编号0517—6611(2012)22-_11415—03StudyonScreeningofB~ic／／／ussubfil~(nafo)forNattoProductionZIIANGXin(ChinaNationalResearchInstituteofFoodandFermentationIndustries，Bering100027)Abstract[Objective]Toscreentheoptimumbacteriafornattoproduction．[Method]Withthe16strainsofBacillussubtil~(natto)asini—tialstrains。thebeststrainfornattoproductionwasscreenedoutaccordingtotheirprotease，nattokinaseandviscosity(r—PGA)productionperformanee．『Result]Basedonoverallconsideration，DL一1521hadthehighestprotease，nattokinaseandviscosityproductionperformance，thusitwasusedastheexcellentstrainfornattoproduction．1ConclusionlTheexperimentprovidesgoodstrainsfornattoproduction．KeywordsBacillussubtilis(natto)；Nattokinase；Viscosityproductionperformance；Screening’纳豆是大豆经纳豆芽孢杆菌发酵而成的，营养丰富，且萄糖、蔗糖、NaC1、KC1、CaC12、MnSO4、MgSO4·7H2O、FeSO4、含有多种功效成分，如强效溶栓物质纳豆激酶(NK)、抗氧Na2HP04、NaH2PO4、KH2PO4、Tween一8O，均为国产化学纯化作用的超氧化物歧化酶(SOD)、r一聚谷氨酸(r—PGA)、异试剂。黄酮、皂苷及多种维生素等。纳豆最典型的特征是搅1．1．3培养基。营养琼脂(NA)、营养肉汤(NB)，购于北京拌后产生大量的黏液，其主要成分为r—PGA。纳豆芽孢陆桥技术有限责任公司。脱脂牛奶培养基：脱脂牛奶l％。杆菌(Bacillusnatto)并非分类学上的名称，应隶属枯草芽孢添加2％琼脂即为脱脂牛奶平板培养基。脱脂豆粉培养基：杆菌(Bacillussubtilis)。由于纳豆芽孢杆菌以外的枯草杆菌脱脂豆粉1％。GSP产黏培养基：大豆蛋白胨1．0％，蔗糖发酵大豆不能产生纳豆特有的黏丝，因此在生产上仍将这3．0％，谷氨酸钠1．5％，KH2PO40．25％，Na~HPO0．17％，类用于纳豆发酵的枯草芽孢杆菌称之为纳豆芽孢杆菌(Ba—NaC10．05％，MgSO4·7H2O0．05％，生物素100g／L，pHcillusnatto)一。6．8～7．0。添加2．0％琼脂即为GSP平板培养基。国内对纳豆芽孢杆菌的研究主要侧重于对纳豆激酶的1．1．4设备。BH一2型偏光显微镜，日本OLYMPUS公司；研究，对纳豆芽孢杆菌菌剂尤其是纳豆发酵剂芽孢悬液的研蒸汽灭菌锅，上海申安医疗器械厂；超净工作台，北京昌平长究鲜有报道，相关研究还处于生物学特性、固体培养等基础城空气净化工程公司；20PR-52D型高速冷冻离心机，日本日研究阶段。目前，纳豆的工业化生产均采用直投式菌剂立集团；BPH．9082型恒温培养箱，上海一恒科学仪器有限公作为发酵剂。日本已有商业化的纳豆发酵剂产品，主要有3司；DK一8D型电热恒温水浴锅，上海森信实验仪器有限公司。家企业占据市场份额。国内生产企业多进口日本纳豆发1．2方法酵剂，严重制约了我国纳豆产业的发展。因此，亟需开发具1．2．1纳豆的制备。取定量豆粒完整、金黄色无杂质的有自主产权的纳豆直投式菌剂产品以打破国外产品的垄断，大豆，用水清洗后室温浸泡20h，沥水，121℃蒸煮25min。而纳豆生产优良菌株的筛选是制备直投式菌剂的前提。笔用无菌水稀释适量的芽孢悬液至106cfu／mt，按照1g湿豆接者以蛋白酶、纳豆激酶及产黏(r—PGA)性能为综合指标，筛选种10个芽孢的接种量接种至蒸煮过的大豆(冷却至80℃出1株适合纳豆生产的纳豆芽孢杆菌，为纳豆直投式菌剂的左右)，4o℃发酵16h后转入2～8℃冰箱后熟1d，且p为鲜制备提供优良菌株。纳豆。1材料与方法1．2．2高产蛋白酶、纳豆激酶及SOD酶菌株的筛选。1．1材料1．2．2．1初筛。将目标菌株分别接种到营养肉汤试管中，1．1．1菌种。纳豆芽孢杆菌XSE11、GQ、AE111、DJ、X6、37℃，200r／rain培养24h。各取1ml于离心管中，4℃，X16、X20、X28、X29、F4、F5、F11、FI4、F23、DL一1521，为实验室10000r／min离心10rain，取上清于另一无菌离心管中重复保藏菌株；纳豆芽孢杆菌CICC10023，由中国工业微生物菌离心1次；取上清各5l点样到脱脂牛奶平板，37℃培养8种保藏管理中心实验室提供。h。测量透明圈大小。1．1．2试材与试剂。市售大豆；大豆蛋白胨、谷氨酸钠、葡1．2．2．2复筛。将初筛所得菌株分别接种大豆发酵纳豆，按照(GB／T23527-2009蛋白酶制剂》[1lj的方法测定产品中作者简介张欣(1986一)，男，陕西韩城人，硕士研究生，研究方向：微性蛋白酶活力。进一步通过纤维蛋白平板法，从中性蛋白酶生物茵剂．Email：0509034116@163．con。收稿日期2012~3-22活力较高的菌株中筛选出纤溶活性(即纳豆激酶活性)最高 Jl4l6安徽农业科学的菌株。纤维蛋白平板筛选法操作如下：①制备纤维蛋白平激酶活力，同时也印诩i了李立民等学者之前的研究结沦板取0．5g琼脂糖、0．05,nol／L硼酸盐冲液(pH7．8)45ml于锥形瓶中，煮沸后冷却至45～50o[：，加入预先配好的10．0rag／ml纤维蛋白原溶液2．5ml，迅速混匀，再加入10．0In]凝血酶(20U)，迅速混匀后倾注平板，凝同后即为透明的纤维蛋白平板。②纳稀释样品制备：．取蛋白酶活力最高的3株菌制备的鲜纳豆各50g，用蒸馏水稀释，搅拌充分后定容至IfK,)ml，12000r／min离心5inin、取上清备j{j．⑧取上清液各101点样于制备的纤维蛋t't平板，37．℃培养8h。通过比较平板上各透明的大小，筛选}}I纳瓦激酶活力最高的菌株、1．2．3产黏菌株的筛选．1．2．3．1初筛、将各菌株接种到营养肉汤试管巾，37℃，fi：：菌侏I)l一I521、AE111、XS1：I1分圳简’为1521、AE、xs200r／min培养24h。各墩4txl点接种于产黏培养平板．图l不同菌株在牛奶平板上的透明圈观察各菌落是否有黏液，Ⅲ牙签挑起是否冉黏丝。表1不同菌株在脱脂牛奶平板上的溶圈直径mm1．2．3．2复筛．、将初筛所得菌株接种于50mlGSP液体摇株溶圈直径蔺株溶圈1．I=径瓶培养，37℃，200r／rain培养2d。发酵液4℃，8000r／min1)l_一l52ll5．O¨l14．5A1Ill1．OF14l5()离心30min，弃菌体。上清液中加入2倍体积95％的预冷乙GQ15．5F2314．()醇，现蛋清状物质。缓慢旋转角瓶，使其成，川镊子夹XSEl1<5．0X615．0f}f，冻干后称重。loo23】2．OXl67．()2结果与分析DJIl9．0X2O7．5F4l6．0X281102．1高产蛋白酶及纳豆激酶菌株的筛选李立民等研究13．OX29】3．O发现，菌株的纳豆激酶与蛋白酶活性有正相关性，即酪蛋水解能力强的菌株通常血纤维蛋白溶解能力也强”。笔者研究设计通过测量脱脂牛奶平板上的透明陶大小，反映菌株酪蛋白水解活性，初步挑选ffJlO株菌、F5、F11、FI4、F23、1521、GQ、X6、X29、CICC10023作为初筛菌株(图1和表1)。≈R进一步将筛选的l0株菌分别接种大豆发酵制备纳豆，测蠼嚣蛆定纳豆中性蛋白酶活力(图2)。结果示，菌株DL一1521、GQ、F4和F11的蛋白酶活力较高分别为298、28l、225和141U／g。蛋白酶活力较高的3株菌(DL一1521、GQ和F4)再经纤维蛋白平板法筛选出纤溶活性(即纳豆激酶活力)最高的菌者一菌株株，结果如罔3所示，菌株纳豆激酶活力大小为：菌株DL一1521>GQ>F4。菌株DL-152l具有最高的蛋白酶活力和纳图2不同菌株产中性蛋白酶活力比较图3菌株纳豆激酶活力比较 4J0卷22期张欣纳豆生产优良菌株的筛选研究114l72．2产黏菌株的筛选l6株菌在GSP产黏平板上的菌落综合筛选指标，从16株目标菌株中筛选出1株性能最优的形态如图4所示。用牙签挑起观察菌落黏度及拉丝状况，纳豆生产菌株——B∞subtil~(natto)DL-1521。该试验DL一1521、XSE11、DJ、GQ、10023菌落黏度较高，用牙签挑起有所进行的研究仅是为制备纳豆直投式菌剂做铺垫，对于纳豆明显的拉丝。进一步对这5株菌进行摇瓶产黏培养，测定芽孢杆菌芽孢的培养、收集、纯化等关键技术还有待进一步r—PGA粗品含量。得出菌株XSE11和DL一1521的r—PGA粗品深入研究。产量较高，分别为(4．320±0．166)、(3．846±0．169)g／L；菌参考文献株10023、GQ、DJ较低，依次为(2．677±0．300)、(1．537±[1]SUMIH，HAMADAH，TSUSHIMAH，eta1．Anovelfibrinolyticenzyme(nattokinase)inthevegetablecheeseNatto；atypicalandpopularsoy-0．110)、(1．032±0．235)g／L。beanfoodintheJapanesediet『J]．CellularandMolecularLifeSciences，1987，43(10)：1110—1111．[2]段智变．纳豆[M]．北京：中国农业科学技术出版社，20O9．[3]陈咏竹，孙启玲．r一多聚谷氨酸的性质、发酵生产及其应用[J]．微生物学通报，2004，31(1)：122—126．[4]周建平，郭华．纳豆黏液成分分析[J]．食品工业科技，2o03(4)：32—34．[5]BUCHANANRE，GIBBONSNE．伯杰氏细菌鉴定手册[K]．北京：科学出I土，1984：735—792．[6]STEINKRAUSKH．Industrializationofindigenousfermentedfoods，revisedandexpanded[M]．NewYork：MarcelDekker，Inc．，2OO4．[7]黄占旺，魏萍，刘海林，等．纳豆菌生物学特性研究[J]．江西农业大学学报，2O04(1)：83—85．[8]杨郁，张丽靖，天知诚吾．纳豆激酶高产菌株筛选及发酵条件优化[J]．现代食品科技，2OO7(1O)：22—25．[9]鲍艳霞，钱之玉，陈钧，等．豆渣固体发酵产纳豆激酶的工艺优化及其部分酶学陛质研究[J]．大豆科学，2OO5(1)：43—47．[10]SAORIMITSUBOSHI，KANKIUCHI．Developmentofnewitohiki-nattoandodorofnattotypefoods[J]．J．JapanAssociationonOdorEnviron-ment，2OO7，38(3)：151—162．图4GSP平板上的菌落形态[11]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会．中华人民共和国国家标准(GB／T23527-2009)．蛋白酶制剂综合考虑，菌株DL．1521具有最高的蛋白酶、纳豆激酶[S]．北京：中国枥隹出生，2009．和较高的产黏特性，具备作为纳豆生产优良菌种的特性。[12]杨雪鹏，钟桂芳，胡全，等．高产聚谷氨酸菌株的选育及鉴定[J]．现代食品科技，2009(9)：1056．3结论[13]李立民，惠洪文，郭军．纳豆激酶生产菌的定向筛选[J]．内蒙古农业以蛋白酶活力、纳豆激酶活力和产黏(r—PGA)性能为大学学报，2002(4)：107—109．(上接第11414页)[3]曹惠君，李建红，李玉红．北京市市售金针菇中二氧化硫残留量监测结果分析[J]．职业与健康，2OO8，24(22)：2413—2414．从试验数据和分析结果可以看出，酱腌菜中二氧化硫残[4]中华人民共和国卫生部．GB／T601-21302化学试剂标准滴定溶液的制留污染严重，如果不加以控制，必定会对消费者的健康造成备[s]．北京：中国标准出版社，20O2．[5]中华人民共和国卫生部．GB／T5OO9．34-2003食品中亚硫酸盐的测定巨大的危害，应引起监管部门重视，采取有效措施，减少二氧[S]．北京：中国标准出版社，2OO3．化硫残留。笔者建议：①对有关生产调配人员进行食品添加[6]中华人民共和国卫生部．GW2760-2011食品安全国家标准食品添加剂使用标准[s]．北京：中国标准出版社，2011．剂卫生知识的培训，宣传二氧化硫残留对人体的危害，减少添加亚硫酸盐的随意性。②消费者尽量购买定型包装酱腌[7]张爽．酱腌菜防腐保鲜技术研究进展[J]．安徽农业科学，2011，39(11)：6538—6539，6542．菜，少购买散装样品，散装样品长期暴露在空气中，不仅会发[8]黄志波，吴春梅，李敬钊，等．固相萃取一超高效液相色谱一质谱／质谱生氧化，且受到污染的可能性也较大。③相关部门加大酱腌法同时测定蔬菜中7种杀菌剂的残留量[J]．广东农业科学，2011(24)：8O一83．菜行业的监管力度，质监、工商联合行动，从市场和生产场所[9]WANGXW，WANGQ，WANGHL．Determinationof2amidespesticide一起抓，加强监督管理，加大执法力度和检测力度，掌握其污residuesinagriculturalproductsbyterabertztime-domainspectroscopy染水平，对于生产和销售超标酱腌菜的企业和摊贩加大处罚[J]．AgriculturalScience＆Technology，2010，l】(8)：53-56．[1O]卢艳芬，周莹，王兰平．液相色谱一电喷雾质谱法测定畜禽肉中氯霉力度。素残留量[J]．畜牧与饲料科学，2008，29(3)：33—35．参考文献[11]Q1JQ，WANGKQ，ZHOUQ，eta1．Studyontheremov~ofearbendazimresiduesbycombinationofCa(ClO)2and03[J]．AgriculturalScience＆[1]周德庆．亚硫酸盐在食品加工中的作用及其应用[J]．食品科学，2O04，Technology，201l，12(11)：1662—1666．25(12)：198—201．[12]封倩，李翠枝，郭军．抗生素残留检测指示菌的初步筛选[J]．畜牧与[2]江朝华．蜜饯中二氧化溅留量检测及超标问题分析[J]．农业研究与饲蒂学，2O09，30(3)：40—42．应用，2011(2)：29—31．