质粒小提试剂盒使用说明书.doc

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1、质粒小提试剂盒I简明步骤（PD1211）（详细内容请参考英文说明书）I.实验前准备II.注意事项RNaseA:使用前将提供的所有RNaseA瞬时离心后加入BufferA1,使用后将BufferA1/RNaseA置于4oC保存。质粒拷贝数:纯化中低拷贝的质粒时，使用2倍的菌液体积，2倍的BufferA1,B1,N1,相同体积的WashBuffer和ElutionBuffer.转化菌:若为-70oC甘油冻存的菌，请先涂布平板培养后，再重新挑选新的单个菌落进行培养。切勿直接取冻存的菌种进行培养。DNAWashBuffer*:使用前请将8mL(PD12

2、11-00)或48mL(PD1211-01)或216mL(PD1211-02)or90mL(PD1211-03)96-100%乙醇加入DNAWashBuffer。BufferB1:在低于室温时会沉淀，请于50oC左右水浴加热至沉淀完全溶解，溶液澄清，使用后保证BufferB1瓶盖旋紧。在室温下（22-25oC）进行所有离心操作。III.操作步骤1.接种新鲜的单个菌落到1-5mL的LB培养基（含适量抗生素），37oC震荡培养14-16小时。室温下10,000xg离心1分钟，收集菌体，并尽可能的吸去上清。注：残留的液体培养基容易导致菌液裂解不充分，

3、第5步离心后沉淀较松，不能有效吸取上清。注：本说明书中的操作程序适用于标准LB（LuriaBertani）培养基培养12-16小时后，OD600（细菌密度）在2.0-3.0之间的菌液。若采用的是富集培养基，例如TB或2×YT，请注意保证OD600不超过3.0。2.加入250µLBufferA1（确保已加入RNaseA），用移液枪或涡流震荡充分悬浮细菌细胞。注：细菌细胞如果没有充分悬浮均匀，将导致菌体裂解不完全，从而降低产量。3.加入250µLBufferB1,轻轻地反转5-10次以混合均匀，然后静置2-5分钟至溶液粘稠而澄清。注：切勿剧烈振荡。

4、静置时间不超过5分钟，时间过长会导致基因组DNA污染或质粒受到损伤。若溶液未清亮澄清，则表明菌体裂解不充分，应加大BufferB1的用量或减少菌体量。4.加入350µLBufferN1,立即反转多次，至溶液充分混匀，此时出现白色絮状沉淀。5.将离心管转至高速离心机，在室温下13,000rpm离心10分钟（若上清中有白色沉淀，可再次离心）。6.小心吸取离心后的上清液至带有收集管的DNA柱中（避免吸起沉淀），室温下13000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将离心柱重新放回到收集管中。7.可选:向DNA柱中加入500µLBufferKB,室温下

5、13000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将离心柱重新放回到收集管中。注：此步对富含内源核酸酶的宿主菌（endA＋）来说是必须的，如HB101,JM101,TG1等；对endA-来说可省略，如Top10和DH5a等，请参照英文说明书第3页的表2.8.向离心柱中加入500µLDNAWashBuffer（确保已加入无水乙醇），室温下，13000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将离心柱重新放回到收集管中。可选步骤：重复步骤“8”。9.将离心柱放回高速离心机中，13000rpm室温下开盖离心2分钟，以彻底去除残留的乙醇。注：此步骤中开盖离心

6、将会更有效的去除残留的乙醇，乙醇是否去除干净将会影响最后的洗脱效率。10.将离心柱转至一个新的1.5mL离心管中，向DNA柱的正中间加入50~100µL（体积>50µL）的ddH2O（pH在7.0-8.5之间）或ElutionBuffer，室温放置2分钟，13000rpm离心1分钟，洗脱质粒DNA。注：提取到的质粒DNA可直接用于基因克隆、测序、酶切、文库筛选、体外转录翻译、转染HEK293细胞。若用于转染内毒素敏感性细胞株，原代细胞及用于微注射，建议去除内毒素（PD1212）。IV.DNA浓度及纯度DNA浓度(µg/mL)=OD260x50x

7、稀释倍数，OD260/OD280约为1.7-1.9V.常见问题及解答1、没有提出质粒或者质粒收获量很低A、菌种老化：ü建议：对于甘油保存的菌种，需要先进行活化。涂布或者划线菌种，重新挑选单菌落进行液体培养，并对菌种进行初摇活化，按照1：500的比例进行菌种培养。二次培养细胞最好不要超过16小时。B、低拷贝质粒：ü建议：如果是由于低拷贝质粒引起的质粒收获量低，可以采用两倍的菌体量，并相应增加各种Buffer的用量，如果必要，更换具有相同功能的高拷贝质粒载体。C、质粒丢失ü建议：某些质粒在多次继代培养的过程中会出现丢失的现象，另外检查筛选抗生素的浓

8、度是否正确。D、裂解不充分ü建议：如果采用超过推荐量的菌体进行质粒制备，会导致菌体裂解不充分。可适当减少菌体的用量或者相应增大各种Buffer的用量。