质粒小提提说明书

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1、质粒小提实验步骤这个操作方案可以从过夜培养的1.0-5.0ml培养物能得到5-30μg的高拷贝数的质粒或1-10ug低拷贝数的质粒DNA。如果需要提高低拷贝数质粒的产量，按下面的低拷贝数的方案。1.将带有目的质粒的E.coli接种于裝有5mlLB/氨苄青霉素的10-20ml的培养管，37℃搖床培养12~16h，以扩增质粒。用一个10-20ml培养管或培养瓶，其体积至少有培养基的4倍。建议使用endA敏感型的E.coli菌株来作常规质粒的分离，例如DH5α®和JM109®等菌株。2.取1.5~5.0ml的菌液，于室温下10,000xg离心1min以沉淀菌种。3.倒出或吸出培养基，弃

2、去。往沉淀中加入250μlSolutionⅠ/RNaseA混和液，漩涡振荡使细胞完全重新悬浮。细胞沉淀的完全重悬对于获得高的产量是十分重要的。4.往重悬混和液中加入250μlSolutionⅡ，轻轻颠倒混匀7-10次。如有必要，可把裂解液置于室温静置2min，避免剧烈混和裂解液，否则会使染色体DNA断裂而使得到的质粒纯度降低。裂解反应不要超过5min。（当使用完SolutionⅡ以后，须盖紧其瓶盖保存好，避免与空气中的CO2反应。）5.往上述混和液中加入125ul冰浴BufferN3，并温和地上下颠倒离心管数次混匀，直至形成白色絮狀沉淀。6.室温下，≥12000xg离心10min

3、。7.小心将上清倒入干净的1.5ml离心管中，加入0.1倍体积的ETR溶液（蓝色）至上清液中，颠倒试管7-10次，然后于冰浴中静置10min。注意：在加入ETR溶液后，裂解液可能出现浑浊，但冰浴后将逐渐转为澄清。8.将上述裂解液于42℃下静置5min。裂解液又将再次出现浑浊。此时，立即于25℃12，000xg离心3min，ETR溶液将在试管底部形成蓝色分层。9.将上清液移至另一新的1.5ml离心管中，加入1/2倍体积室温的无水乙醇，轻轻颠倒试管6-7次，室温放置1-2min。10.取一干净的HiBindMiniColumns(I)裝在一个2ml收集试管上(已备)。小心吸出上清，取

4、700ul样品溶液将其转至于柱子內，于室温下10,000xg离心1min，使裂解液完全流过柱子。(HiBindDNA柱子一次最多能装700ul溶液)11.弃去收集管种的滤液，将剩余的样品溶液转移至柱子中，于室温下10,000xg离心1min，使裂解液完全流过柱子，弃滤液。12.把柱子重新装在收集管中，加入500μlHBBuffer柱子上，室温下10,000xg离心1min洗涤柱子，确保除去残余的蛋白质以得到后面操作所需的高质量DNA。13.弃去收集液，加入700μlDNAWashBuffer(用无水乙醇稀释的)洗涤柱子，室温10,000xg离心1min，弃去洗涤液。注意：浓缩的D

5、NA洗涤缓冲液在使用之前必须按标签的提示用乙醇稀释。如果DNA洗涤缓冲液在使用之前是置于冰箱中的，须将其拿出置于室温下。14.重复步骤13，再用700μl的DNA洗涤缓冲液洗涤柱子一次。15.室温下最高速（≥13,000xg）离心空柱2min以甩干柱子基质。注意：不要忽略此步――这对从柱子上除去乙醇至关重要。16.把柱子置于一干净的1.5ml小离心管上，直接加入30~50μlElutionBuffer（或无菌去离子水，或10mMTris-HCl，pH8.5）到柱子基质上（所加的量取决于预期终产物浓度），室温下静置2min。≥13,000xg离心1min以洗脱出DNA。这步可以洗脱

6、70-85%的DNA，若进行第二次洗脱则可得到大部分残余的DNA，只是浓度较低。低拷贝数质粒方案:低拷贝数的质粒通常情况下从每毫升过夜培养的菌液中可得到0.1-1ugDNA。对于从低拷贝数质粒（0.1-1ug/ml培养基）或低-中量拷贝数质粒（1-2ug/ml）细菌中分离质粒，如有需要，可以通过改良这方法来提高产量。开始用10-15ml菌液，15ml离心管5000xg离心10min。进行方案1的第3步，加入两倍体积的溶液Ⅰ、Ⅱ、N3、ETRSolution。用一个微量结合柱继续按照前面的操作进行，。不须要加大HB和WashBuffer的用量。溶液Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ可以单独购买。注意：这方

7、法不适用于高拷贝数质粒，因为超过15ml培养基，大量结合柱很快就会饱和。这种情况下，我们推荐把同一培养基里的样品分成多个样品处理。