质粒提取试剂盒-说明书-翻译.docx

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1、E.Z.N.A.™质粒小提试剂盒操作规程（英文版译文）（适用于No.D6942,D6943&D6944）1.自新鲜划痕选择培养板中分离单菌落，接种含适当选择性抗生素的1-5ml的LB培养基进行培养。37℃强力摇动（~300rpm）孵育12-16h。使用10-20ml培养管或容量至少4倍于培养容积的培养瓶。强烈推荐使用endA阴性大肠杆菌菌株进行常规质粒分离。此类菌株包括DH5α和JM109。2.将1.5-5.0ml细菌室温10,000xg离心1min。轻轻倒出或吸走培养基并丢弃。3.加入250μl的溶液I/RnaseA重悬沉淀，涡旋或用移液器反复

2、吹打。充分重悬沉淀对于获得高质量的DNA非常重要。4.加入250μl溶液II，倒置、转动试管数次使之轻轻混匀，得到透明的裂解产物。可能需要孵育2min。不要用力混合，以免使染色体DNA断裂，减低质粒的纯度。该步反应不要超过5min。溶液II不用时要拧紧瓶盖，以免试剂被空气中的CO2酸化。5.加入350μl溶液III，立即倒置试管数次混匀，直至白色絮状沉淀物形成。为避免形成局部沉淀，加入溶液III后应立即、充分混匀溶液。6.室温≥10,000xg离心10分钟。白色沉淀物形成，立即进行下一步操作。7.小心翼翼的吸取上清液，加入装配在2ml收集管中的小

3、量纯化柱I中。确保离心沉淀未受扰动，确保没有细胞碎片加入到柱子中。室温下10,000xg离心1分钟，使裂解液完全通过柱子。8.丢弃滤过液，重新使用2ml收集管；加入500μlHB缓冲液清洗柱子，室温10,000xg离心1分钟，使溶液完成通过柱子。该步操作需确保残余的蛋白质污染被去除，以保证获得高品质的DNA以适合于下游的应用。9.丢弃滤过液，重新使用2ml收集管；加入700μl用无水乙醇稀释的DNA清洗液清洗柱子，室温10,000xg离心1分钟，使溶液完全通过柱子，丢弃滤过液。注意：DNA清洗液的浓缩液使用前必须用无水乙醇稀释（5倍稀释），如果D

4、NA清洗液稀释液经过冷藏，则使用之前必须置于室温。10.可选步骤：重复清洗，加入另外的700μl用无水乙醇稀释的DNA清洗液。11.将空柱子≥13,000xg离心2min，使柱子的基质干燥。此步骤为关键操作，不可遗漏。12.将柱子放入干净的1.5ml微量离心管中。将30-50μl（取决于终产物的期望浓度）洗脱液或无菌去离子水直接加入柱子基质上，使之于室温下静置1-2min。≥13,000xg离心1min洗脱DNA。可以进行二次洗脱，以收集残存的DNA。13.DNA的产量和质量：分别在波长260nm和280nm处测定样品适当稀释液的吸光度。DNA的

5、浓度计算如下：DNA浓度=A260×50×（稀释倍数）μg/mlA260/A280的比率可以反映核酸的纯度。比值大于1.8表明核算的纯度在90%以上。或者，DNA的产量（及质量）有时可以通过琼脂糖胶/溴乙锭电泳与已知浓度的DNA样品相比较更好的予以确定。通常情况下洗脱的大部分DNA是超螺旋单体形式，但也可能存在串联体形式。张小强翻译