大片段质粒DNA小量试剂盒说明书.doc

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1、杭州新景生物试剂开发有限公司区地址：浙江省杭州市西湖科技经济园金蓬街366号1幢东4F邮编：310030电话：0571-87381295传真：0571-87381297大片段质粒DNA小量试剂盒说明书产品组成大片段质粒DNA小量试剂盒Cat.No.5次样品100300550次制备1003050RNaseABufferIBufferIIBufferIIIBufferBBufferW2（浓缩液）BufferE说明书*1.5ml1.5ml2ml2ml2.4ml0.6ml1份28μl14ml14ml30ml18ml24ml12ml1份*5次样品中的RNaseA已加入到Buf

2、ferI中。产品储存1.RNaseA可室温运输，收到产品后请将RNaseA置于2-8℃贮存。2.加入RNaseA的BufferI请置于2~8℃贮存。如果BufferI储存时间超过6个月，需补加RNaseA至终浓度为100μg/ml。3.其他试剂与物品如果储存于室温（15~25℃），可在两年内保持使用性能无明显变化；如果将产品储存于2~8℃，可延长产品的有效期至两年以上（2~8℃储存的产品使用前应先使产品恢复到室温后再使用）。技术支持杭州新景生物试剂开发有限公司研发部：e-mail:technical@simgen.cn,电话：400-0099-857。产品介绍本试剂

3、盒采用了碱裂解法分离大片段质粒DNA，特殊设计的硅胶树脂DNA纯化技术确保大片段质粒DNA免于剪切，适合从3～5ml细菌培养物（LB培养基）中提取大片段的质粒DNA（10-200kb），适用于测序、体外转录与翻译、限制性内切酶消化、细菌转化等分子生物学实验。用户需自备的试剂与物品1．无水乙醇2．1.5ml离心管、移液器及吸头3．一次性手套、纸巾及防护用品4．台式小量离心机（可配离心1.5ml离心管和2ml离心管的转子）5．旋涡振荡器使用前准备1）如果离心机有制冷功能，请将温度设置到25℃。2）根据试剂瓶标签上的指示在BufferW2中加入无水乙醇，并在标签的方框中打

4、勾作好“乙醇已加”的标记。3）当室温低于15℃时，使用BufferIIwww.simgen.cn仅供科研使用，请勿用于人体及动物的治疗或临床诊断。Ver.2杭州新景生物试剂开发有限公司区地址：浙江省杭州市西湖科技经济园金蓬街366号1幢东4F邮编：310030电话：0571-87381295传真：0571-87381297前应先观察试剂是否有白色沉淀产生，如有沉淀则应于37℃水浴直至沉淀溶解后再使用。操作步骤1）12000rpm离心30秒收集3-5ml过夜培养的细菌，弃尽培养基。加入250μl已加入RNaseA的BufferI，充分悬浮沉淀的细菌。*可用旋涡振荡器振

5、荡或用移液器反复吸注的方法悬浮沉淀的细菌块。充分悬浮的细菌呈均一的悬浊液，不应留有可见的小菌块，否则将严重影响最后质粒的产量。2）加入250μlBufferII，温和并充分地翻转离心管4-6次。*使用BufferII前确认溶液中没有可见沉淀存在；BufferII使用完后应盖紧瓶盖，避免与空气长期接触。*此步骤不可用旋涡振荡器混匀，否则将导致最后制备的质粒中混有基因组DNA。*当细菌裂解充分时，溶液应呈粘稠的半透明状；如果达不到上述效果，可能为细菌用量过多所至，可增加翻转的次数以达到细菌充分裂解的效果。*此步骤不应超过5分钟。3）加入350μlBufferIII，温和

6、并充分地翻转离心管直至溶液中残留的蓝色沉淀全部消失，转变为淡黄色沉淀。4）13000rpm离心10分钟。将离心上清液倒入一个洁净的1.5ml离心管中。5）漩涡振荡BufferB使其中的介质全部悬浮起来，加入300μlBufferB，温和地翻转6-8次混合均匀，3000rpm离心30秒。*此步骤不可用漩涡振荡，否则可能导致大片段DNA的断裂。6）弃尽1.5ml离心管中的上清液，加入750µlBufferW2,温和地反复翻转离心管直至沉淀完全分散开来。3000rpm离心30秒。*确认在BufferW2中已经加入无水乙醇。*此步骤不可用漩涡振荡，否则可能导致大片段DNA的

7、断裂。如果沉淀不容易散开，可轻弹管壁使沉淀散开。7）重复步骤6）一次。8)12000rpm离心30秒，小心地用移液器吸弃上清液。盖上管盖，低速离心数秒使管壁上的溶液沉淀到管底。9）小心地用20－200µl移液器尽可能吸尽并丢弃上清液。室温晾干沉淀。*沉淀晾干时应呈白色粉末状。*可以将离心管放置到37℃恒温箱中加快干燥速度，但不应用负压干燥，因为负压干燥会导致过度干燥而影响DNA的洗脱效率。10）加入30－50µlBufferE，用手指轻弹离心管使沉淀分散开来，50℃水浴10分钟。*也可用去离子水洗脱DNA，但应确保所使用的去离子水的pH在7.0-8.5，否则将影