实验一质粒dna的小量制备

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1、实验一质粒DNA的小量制备一实验原理什么是质粒？质粒是细胞内的一种环状的小分子DNA，是进行DNA重组的常用载体。作为一个具有自身复制起点的复制单位独立于细胞的主染色体之外，质粒DNA上携带了部分的基因信息，经过基因表达后使其宿主细胞表现相应的性状。在DNA重组中，质粒或经过改造后的质粒载体可通过连接外源基因构成重组体。根据共价闭合环状质粒DNA与线性DNA在拓扑学上的差异来分离。在pH12.012.5这个狭窄的范围内，线性DNA双螺旋结构解开而被变性。当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液使pH恢复中性时，共价闭合环状质粒DNA

2、复性快，而线性的染色体DNA复性缓慢，经过离心与蛋白质和大分子RNA一起沉淀下去。一实验原理分离质粒DNA有三个步骤：培养细菌使质粒扩增，收集和裂解细菌，分离和纯化质粒DNA。一实验原理在质粒提取过程中，由于机械力、酸碱度、试剂等的原因，可能使质粒DNA链发生断裂。所以，多数质粒粗提取物中含有三种构型的质粒：共价闭合环状DNA（cccDNA）：质粒的两条链没有断裂；超螺旋开环DNA（ocDNA）：质粒的一条链断裂；松弛的环状分子线形DNA（lDNA）：质粒的两条链均断裂；一实验原理pGEX-6p质粒载体菌,LB培养基1000ml

3、（含100ug/ml氨苄青霉素），葡萄糖/Tris/EDTA(GTE)溶液（溶液I），NaOH/SDS溶液(溶液II)，KAc溶液（pH4.8）(溶液III)，RNaseA，95%乙醇，70%乙醇，TEbuffer（pH8.0）。二实验试剂1氨苄青霉素储存液（无菌水配制5mg/ml，分装后-20C保存），2配制LB培养基（胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g加200mLddwater搅拌完全溶解，用约200L5NNaOH调pH至7.0，加ddwater至1L，121C20min灭菌）；三实验准备3溶液I（50m

4、mol/L葡萄糖，25mmol/LTrisHClpH8.0，10mmol/LEDTApH8.0）；溶液Ｉ可成批配制，每瓶约100ml,在10lbf/in2(6.895¡104Pa)高压下蒸气灭菌15分钟，贮存于4℃。溶液II（0.2mol/LNaOH，1%SDS）；溶液III（60mL5mol/LKac，加冰乙酸调pH4.8，补ddwater至100ml），三实验准备470%乙醇（-20C保存），5TEbuffer（10mmol/LTrisHClpH8.0，1mmol/LEDTApH8.0）；6摇菌试管洗净并盖上棉花塞、1.5

5、ml离心管装入铝制饭盒、移液器吸头装入相应的吸头盒，一起高压灭菌（121C30min）。三实验准备1在超净工作台中取5mlLB（Amp+），加入灭菌的摇菌管中。2取出保存pGEX-6p载体的菌种,在超净工作台上用烧红的接种环刮一下，再把接种环于5ml无菌LB培养液（含100ug/ml氨苄青霉素）中搅拌一下，37C摇床中摇20h。3取1.5ml的菌液于1.5ml离心管中，12000rpm离心1min，弃上清液（尽量弃干净），留沉淀备用。四操作步骤4在沉淀中加入用冰预冷的100l溶液I，盖上盖后立即在涡旋混合器上混匀，室温下静

6、置5min。（等待的同时，取一个塑料盒，装上适量的冰块备用。）须确使细菌沉淀在溶液Ｉ中完全分散，将两个微量离心管的管底部互相接触震荡，可使沉淀迅速分散。5加入200l溶液II，盖紧管口，快速颠倒离心管５次，以混合内容物。应确保离心管的整个内表面均与溶液Ⅱ接触。不要振荡，插入冰中，放置5min。6加入用冰预冷的150l溶液III，盖上盖后上下颠倒几次混匀，插入冰中，放置5min。四操作步骤712000rpm离心5min，小心吸取400l上清液于另一个干净的1.5ml离心管中，（不要将白色沉淀物带入！），加入800l95%乙

7、醇，盖上盖后立即在涡旋混合器上混匀，室温下静置5min。812000rpm离心10min，小心弃掉上清液，加入500l70%乙醇，盖上盖后立即在涡旋混合器上混匀。12000rpm离心10min，小心弃掉上清液，尽量倒置弃干净,9再加入500l70%乙醇，盖上盖后立即在涡旋混合器上混匀。12000rpm离心10min，小心弃掉上清液，尽量倒置弃干净，可将离心管倒置于一张纸巾上，以使所有液体流出。四操作步骤10离心管倒置于37C培养箱中（或室温）空气干燥10分钟。。（管底的沉淀质粒DNA用肉眼几乎看不见！）。11每管加入10

8、LTE缓冲液混匀后收集到一个管中，涡旋混合器上混匀，在离心机中瞬时转一下，使溶液集中在管底。待电泳确认，用记号笔标记后放入冰箱中备用。12在剩余的菌液中倒入少许84消毒液，待溶液变清亮后随废液和剩余的冰块一起倒入下水池。清理桌面，清洗仪器，撰写实验报告四操作步骤