实验八 质粒DNA的小量制备.ppt

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1、实验八质粒DNA的小量制备一般操作步骤：培养细菌使质粒扩增收集和裂解细菌分离质粒DNA碱变性法煮沸法去污剂法有机溶剂法一、实验目的掌握碱裂解法提取质粒DNA的原理熟悉碱裂解法提取质粒DNA的方法分离质粒DNA需要去除的：大肠杆菌染色体DNA蛋白质RNA二、实验原理碱变性法抽提质粒的原理碱变性抽提质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。在EDTA、（溶菌酶）和表面活性剂的存在下，经碱处理溶菌，同时在pH高达12.0~12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺

2、旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离。当以pH4.8的KAc高盐缓冲液去调节其pH至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构。通过离心，染色体DNA、不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。降解的小分子RNA可通过RnaseA处理去除未除净的蛋白质可通过苯酚/氯仿抽提除去。三、实验材料LB液体培养基、氨苄青霉素溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、RNaseA、预冷无水乙醇、70%乙醇、TE缓冲液DH5-pCR2.1-Rv1791提质粒用溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ溶液Ⅰ（细菌重悬液）：50mMTr

3、is-HCl10mMEDTApH7.5溶液Ⅱ(细菌裂解液）：0.4MNaOH2%SDS溶液Ⅲ:1.32MKAcpH4.8(用醋酸调）四、实验具体步骤1.挑取转化平板上的单菌落至2mlLB培养液中（含Amp100μg/ml），37℃，250rpm，培养过夜。2.取1.5ml培养物至指形管中，12,000rpm，30s。3.吸去上清，使沉淀尽可能干燥。4.将细菌沉淀悬浮于200μl预冷的溶液Ⅰ中，剧烈振荡。5.加200μl溶液Ⅱ（新鲜配制），盖紧管口，快速颠倒5次以混匀内容物。冰上放置。6.加入200μl溶液Ⅲ（冰上预冷），盖紧管口，温和振荡，冰上放置3

4、-5min。7.4℃，12,000rpm，5min，将上清转移至另一离心管中。8.加入等体积酚/氯仿（1:1），振荡混匀，4℃，12,000rpm，2min，将上清转移到另一离心管中。(此步也可不做)9.加入2倍体积的无水乙醇，室温静置2min。10.4℃，12,000rpm，5min。11.弃上清，把离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体。12.用1ml70%乙醇洗涤质粒DNA沉淀，弃上清，吸干，在空气中干燥10min。13.加入30μlTE缓冲液（含20μg/mlRNaseA，不含DNA酶），使DNA完全溶解。14.37℃，保温30min，消化RNA，取

5、出置-20℃保存。五.实验结果通过凝胶电泳和紫外分光法检测抽提的质粒浓度及纯度。六、思考题溶液I、溶液II和溶液III在提取质粒的过程中的作用分别是什么？