质粒DNA的小量快速提取.ppt

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1、实验三十质粒DNA的小量快速提取（碱裂解法）CONTENTS实验目的02实验原理03实验背景01实验试剂04实验步骤051.实验背景质粒是染色体外的DNA分子，大小可为1kb到200kb。大多数来自细菌的质粒是双链、共价闭合环状的分子，以超螺旋形式存在。它是细菌内的共生型遗传因子。其复制和遗传独立于细菌染色体，但复制和转录依赖于宿主编码的蛋白和酶。1.实验背景质粒的类型1.严谨型：只在细胞周期的一定阶段进行复制，当细胞染色体复制一次时，质粒也复制一次，每个细胞内只有1~2个质粒。2.松弛型：质粒在整个周期中随时可以复制，当染色体复制停止后，质

2、粒依然能复制，每个细胞中含有10~200个拷贝。1.实验背景质粒的应用大多数基因工程使用松弛型质粒。严紧型质粒用来表达一些可使宿主细胞受毒害致死的基因。质粒的特点使质粒成为携带外源基因进入细菌中扩增或表达的重要媒介物，这种基因运载工具在基因工程中具有极广泛的应用价值。2.实验目的掌握碱裂解法提取质粒的原理、步骤及各个主要试剂的作用。3.实验原理细菌SDS碱性环境变性染色体DNA变性质粒DNA蛋白质—SDS复合物不能复性且形成缠连的网状结构复性并溶解在溶液中蛋白质—SDS复合物取上清液后乙醇沉淀质粒DNA和大分子RNA沉淀下来，用酚/氯仿除去残

3、留蛋白质离心酸性醋酸钾4.实验试剂1.溶液Ⅰ：50mm/L葡萄糖25mm/LTris·HCl（pH8.0）10mm/LEDTA溶液1的作用：分散细胞，蟄合金属离子使金属酶失活。2.溶液Ⅱ：（新鲜配制）0.2mol/LNaOH,1%SDS溶液2的作用：使细胞壁在碱性条件下破裂，核酸和蛋白质变性。3.溶液Ⅲ：5mmol/LKAC10ml,冰醋酸11.5ml,水28.5ml溶液3的作用：使PH值恢复至中性，质粒DNA复性，染色体DNA与蛋白质-SDS复合物沉淀。4.酚—氯仿：作用:使蛋白质变性，进一步除去少量残留的蛋白质5.无水乙醇：作用:除去DN

4、A水化层，使DNA沉淀6.70%乙醇：作用：洗去质粒DNA沉淀中含的少量盐7.RNaseA:核糖核酸酶A作用：降解DNA污染物（RNA）8.TE缓冲液，LB液体培养基4.实验仪器高压灭菌器恒温摇床高速离心机微量可调式移液器1.5m离心管5.实验操作1.细菌培养2.收集菌体3.悬浮细菌4.碱性裂解5.中和与复性6.离心沉淀7.酚/氯仿抽提除蛋白8.乙醇沉淀质粒DNA9.乙醇洗盐10.溶解质粒DNA注意：加入溶液1后，一定要彻底悬浮细菌沉淀，否则所提质粒DNA的纯度及得率会大大降低。注意：此步需轻柔混合，不要剧烈震荡，以免打乱基因组DNA，造成提

5、取的质粒中混有基因组片段。此时菌液应变得清凉粘稠，所用时间不应超过5min，以免质粒受到破坏。如果未变得清亮，可能由于菌体过多，裂解不彻底，应减少菌体量。注意：溶液3加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。细菌培养细菌的收集和裂解质粒DNA的分离和纯化详细步骤：P2065.实验步骤DNA的保存1.短期贮存：4℃或-20℃存放与TE缓冲液中。TE缓冲液的PH与DNA储存有关，PH为8时，可减少DNA脱氨反应，PH低于7.0时DNA容易变性。2.长期贮存：置于TE缓冲液中-70℃可保存数年，在DNA溶液中加一滴氯仿可有效防止细菌和核酸的污染