高纯度质粒小提试剂盒使用说明书

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1、北京厚生博泰科技有限公司BeijingHooseenBiotechCo.,Ltd.高纯度质粒小提试剂盒PureMiniPlasmidKit(目录号：HS0103)产品包装试剂盒成分50prepsBufferP115mlBufferP215mlBufferP320mlBufferPD30mlRNaseA(10mg/ml)150ulBufferPW60mlBufferEB10mlSpinColumnsPA50个CollectionTubes(2ml)50个（注意：使用前将全部RNaseA溶液加到BufferP1中混合均匀

2、，2~8℃保存）保存条件本试剂盒在室温(15~25℃)干燥条件下，可保存12个月；更长时间的保存可置于2~8℃。若溶液产生沉淀，应在使用前置于37℃下溶解沉淀。单独包装的RNaseA在室温可稳定保存12个月。加入RNaseA后的BufferP1应置于2~8℃保存，可稳定保存6个月。产品简介本试剂盒用于高纯度质粒DNA的小量制备与纯化。菌体经碱裂解、高盐、低pH处理，质粒可从菌体中释放出来，并特异、高效地被离心柱硅胶膜（SpinColumnsPA）吸附。通过去蛋白液（BufferPD）和漂洗液（BufferPW）的清洗

3、可去除蛋白及其他杂质，在低盐、高pH条件下洗脱，最后得到高纯度的质粒DNA。使用本试剂盒可从1~5ml过夜培养的菌液中纯化得到高达20ug的高纯度质粒DNA，可在30min之内完成提取任务。所得质粒可直接用于酶切、转化、PCR、测序、低敏感细胞株的转染等各种常规分子生物学操作。产品特点1.快速：步骤少，操作简便，节约时间。2.简便：离心吸附柱不需要预平衡，漂洗液BufferPW和去蛋白液BufferPD不需要另加乙醇，即开即用。3.纯度高：所得质粒可直接用于酶切、转化、PCR、测序、低敏感细胞株的转染等各种常规分子生

4、物学操作。操作步骤1.取1~5ml过夜培养的菌液，室温12,000rpm离心1min，尽量将上清去除干净。（注意：根据菌液的浓度决定取液量，浓度高时取1ml菌液离心即可，浓度低时可多收集一次）2.加入250ulBufferP1，用枪头充分吹打使菌体重悬均匀。（注意：是否将RNaseA溶液加到BufferP1中并混合均匀；菌体沉淀是否悬浮充分，如有未彻底悬浮的菌块会影响裂解，导致提取的质粒浓度及纯度降低）3.加入250ulBufferP2，温和颠倒混匀6~8次，直到溶液变得清亮粘稠。（注意：不可剧烈震荡，以免造成基因组

5、DNA片段的污染，所用时间不要超过5min，以免质粒受到破坏，如未完全变得清亮，可能是菌体太多，可增加BufferP2的用量，在后续的操作中BufferP3的用量也要相应增加）4.加入350ulBufferP3，立即温和颠倒混匀6~8次，可见白色沉淀物产生，室温静置2min，然后12,000rpm离心3~5min。（注意：BufferP3加入后应立即混合，避免产生局部沉淀，如果上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清）5.小心将上清液转移到离心吸附柱SpinColumnsPA中，静置2min，让质粒DNA与吸附柱中

6、的硅胶膜充分结合。12,000rpm离心0.5~1min，弃收集管中的废液。6.向吸附柱中加入500ul去蛋白液，12,000rpm离心1min，弃收集管中废液。（注意：如果宿主菌是endA-，如DH5α若TOP10，此步骤可省略。如果宿主菌是endA+，如TG1、BL21、HB101、JM101等，此步骤不可省略，因这些宿主菌含有大量的核酸酶，易降解质粒。如果提取低拷贝质粒也推荐采用此步骤）7.加入500ul的BufferPW，室温12,000rpm离心0.5~1min，弃收集管中废液。（注意：漂洗液BufferP

7、W中有酒精，用后应立即盖紧瓶盖，以防酒精挥发）8.重复步骤7一次。9.室温12,000rpm离心2min，甩干残留液体。（注意：此步不能省略，否则残留乙醇会影响质粒的后续使用）10.将离心吸附柱SpinColumnsPA置于一个新的1.5ml塑料离心管（自备）中，加入50~100ul的BufferEB，室温放置2min。12,000rpm离心1min，离心管底溶液即质粒DNA。（注意：为增加洗脱效率，可将BufferEB在50~60℃预热。如需使用去离子水洗脱，可用NaOH调整其pH值在7.0~8.5之间，为了增加质

8、粒回收率，可将得到的溶液重新加入到离心管中，室温放置2min，再次离心收集）低拷贝或大质粒（>10kb）提取如果所提质粒为低拷贝质粒或大于10kb的大质粒，应加大菌体使用量，使用5~10ml过夜培养物，同时按照比例增加P1、P2、P3的用量，洗脱缓冲液EB应在65~70℃水浴预热，在吸附和洗脱时可以适当的延长时间，以增加提取效率。其它步骤相同。