皮蝇素转基因小鼠的制备及其抑制皮肤移植排斥的研究

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1、分米Ｖ学巧’Ｉ１＞（密级媛叫大參ＹＡＮｄＺ＇ｌＩＯＬｌＬＭＶＩＲＳｒｉＹ详去学化冷文皮蜗素巧基因小鼠的制备及其抑制皮肤移植排斥的研究胡安康抬导教师姓名：刘宗平教授，扬州大学，江苏扬州２２５００９，小请学位级别：博壬学科专业名称：临床兽医学论文提交日期：２０１５年４月论文答辩日期：２０１５年６月学位授予单位；扬州大学学位授予。期：２０１５年６月￣答辩委员会主席：＾：２０６１５年月皮蜗素转基因小鼠的制备及其抑制皮肤移植排斥的研究Ｔｈｅｒｅａｒａｔｉｏｎｏｆ

2、ｈｏｄｅｒｍｉｎｔｒａｎｓｅｎｉｃｍｉｃｅａｎｄｐｐｙｐｇ，ｉｔｓａｐｐｈｃａｔｉｏｎｉｎｓｋｉｎａｌｌｏｔｒａｎｓｌａｎｔａｔｉｏｎ．ｐ研究生；胡安康学科；临床兽医学导师：刘宗平教授资助项目；国家自然科学基金（３１１７２１７１）江苏省自然科学基金（ＢＫ２０１１２０９）扬州大学２０１５年６月胡女康化蝴素转基闲小鼠的制备及化抑制皮肤移植排巧的研究１皮魄素转基因小鼠的制备及其抑制皮肤移植排斥的研究中文摘要一种较有效的方法器官移植作为治疗终末期器官衰竭患者的，在临床上得到了越来越

3、广泛的应用，，这也使人类器官供体相对缺乏的状况越来严重激起人们对异种移植的强烈兴趣。然而，异种移植后将出现比同种异体移植更复杂的排斥反应。如何解决是保证异种＂＂寄生虫化，及移植器官表达寄生虫某些分泌蛋白器官移植成功关键因素。移植器官，＂＂一使移植物能模拟寄生虫产生免疫逃避，从而长时间在受体内成活，这策略为解决异种器官移植排斥反应提供了新思路一。皮魄素是种可降解补体的丝氨酸蛋白酶，它们在寄生虫和宿主相互关系之间起着重要作用。帮助寄生虫应对宿主组织的侵袭，帮助逃避宿主的免疫系统。＂本研究通过转基因动物方式，使移植器官分泌皮

4、蛹素Ａ、Ｃ蛋白酶，建立移植器官寄＂一步研究皮蜡素与补体系统作用机制生虫化动物模型，应用此模型进。移植器官分泌皮，蜗素抑制受体补体激活，调节各种异种移植排斥反应延长移植物存活时间，为解决异种器官移植排斥反应提供新途径。１．皮蜗素分泌型真核表达载体的构建－－－ＥＦ－－－构建分泌型真核表达载体ｐｌＣＤＨＡＡｃＧＦＰ和ｐＥＦｌＣＤＨＣＡｃＧ巧，该载体Ｗ一ＥＦ－１为启期幼虫ＲＴＰＣＲ扩增出ＨＡ、ＨＣ基因ｃＤＮＡ动子，牛皮蛹为目的基因，序列上－游融合ＩＫ－ｃｈａａｌ。ｌ－Ａｇｉｎｓｅｃｒｅｔｉｏｎｓｉｇｎ信号化序列将韶合基因序

5、列插入ＰＥＦａｌＲＥＳｃＧＦＰ多－－ＥＲＩ和ＢＨＩ双ＥＦＣＤ－ＨＡ克隆位点，应用核酸内切酶ｃｏａｍ酶切，构建ｐｌＡｃＧＦＰ和－－ＥＦ－ｌＣＤＨＣＡｃＧＦＰ重组分泌型。正向反向测序结果ｐ真核表达载体将构建好的质粒测序，一。与预期符合，用于下步体外转染实验和转基因实验２．皮蜗素Ａ抗体的制备及鉴定皮魄素Ａ（ＨｙｐｏｄｅｒｍｉｎＡＨＡ）具有很好的免疫原性，Ｗ其作为免疫抗原，可Ｗ使被免疫的动物产生对牛皮蜗幼虫的感染具有保护性的抗体。利用生物信息学对ＨＡ的抗原性及其亲水性进行分析，提示该氨基酸具有较好的抗原性。并发现抗原表

6、位主要分布在氨基－－１－－酸的Ｃ端１０１１１６，１６１７３，３７５０的Ｈ个区域。通过ＲＰＨＰＬＣ方法测定人工合成的多化发现其纯度运到９１＞。．２％，并通过质谱鉴定分子量与预计的分子量吻合为２８吐然后与ＫＬＨ连接，免疫新西兰大白兔，得到了ＨＡ的多肤抗体。采用ＥＬＩＳＡ和ｗｅｓｔｅｍｂｌｏｔｔｉｎｇ方法验证了抗体的特异性。ＥＬＩＳＡ结果显示制备的ＨＡ多狀抗体特异性识别多狀，且滴度较高。２扬州火学博±学位论文一并同时从牛皮蝴期幼虫中提取蛋白ｅｓｔｅｒｎ，对制备抗体、阴性血清和阳性血清进行ｗｂｌｏｔｉｎｇ检测，结果发

7、现制备抗体和阳性血清分别在２８ＫＤ处有目的条带，而阴性血清没有一。目的条带。制备得到的ＨＡ多克隆抗体为进步研究ＨＡ的分子功能，提供了有用的工具。３．皮蜗轰转基因表达载体体外转染实验－－－－ＥＦ－ＥＦ－ＨＣ－ｃｌＣＤＨＡＡｃＧＦＰ和ｌＣＤＡＧＦＰ体外转染及抗补体损伤研究应用脂质ｐｐ，ＣｏｓＲＴ－ＰＣＲ与ｗｅｓ体法转染７细胞，ｔｅｒｎｂｌｏｔ检测ＨＡ、ＨＣ是否成功表达；并用Ｇ４１８筛选得到了ＨＡ和ＨＣ的稳定表达细胞株。免疫共沉淀实验检测ＨＡ与Ｃ３是否相互作用。ＨＡ稳°投Ａ方法转细胞分别与１０％、４０％的豚鼠血清３７

8、Ｃ解育１００ｍｉｎ，ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ与ＥＬ结果显示１０％的豚鼠血清与ＨＡ稳转细胞脖育后，ＨＡ组较阴性对照达到了极显，占比为