创伤弧菌溶细胞素中类蓖麻毒素功能模序的细胞毒性研究

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1、论文题目：剑笾殛菌盗细胞蠢生娄蓖鏖壹蠢功能槿庄的细胞壹：眭班究答辩委员会主席：拯瞳缝夔攫答辩委员会成员：芒态夔攫昌越越目录中文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．1英文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯3前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．5刖吾⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯5第一部分材-t4-与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．7结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯23：口术⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯‘3分析讨论⋯⋯⋯⋯⋯

2、⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．29第二部分材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．31结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯37；口木⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯J，分析讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．41／J、结⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯43参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯44附录⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯46致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯52综述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯

3、⋯⋯⋯⋯⋯⋯53独创性声明⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．61温州医学院硕士学位论文创伤弧菌溶细胞素中类蓖麻毒素功能模序的细胞毒性研究目的：中文摘要1、创伤弧菌溶细胞素(rVvhA)中类蓖麻毒素功能模序(VVC硒。inB1诹。)的表达、纯化及复性。2、明确WC黜。岫B1溉是否具有溶血活性。3、阐明WC黜咖B1‘k。对HeLa细胞的细胞损伤相关机制。4、了解VVC砌。‘nB1ih抗体对重组蛋白HeLa细胞毒性的阻断作用。方法：1、IPTG诱导VVC硒。inBlike表达、Ni2+亲和层析法纯化、透析复性法复性，Westernblot鉴定

4、。2、绵羊红细胞裂解实验检测VVC‰1nBlih的溶血活性。3、流式细胞仪检测WC胁m引岫作用于HeLa细胞后，细胞的凋亡及坏死率、细胞线粒体膜电位的变化及细胞内活性氧的变化。4、纯化VVCR‘dnBl‘k。免疫日本大耳兔制备VVCRi。访B1ike多克隆抗体。5、硫酸铵盐析法、SephadexG25分子筛法纯化多克隆抗体，Westernblot鉴定重组蛋白的免疫原性，ELISA法确定抗体效价。6、流式细胞仪检测多克隆抗体对VVC胁mB1疵细胞毒性的阻断作用。结果：1、大肠杆菌E．coliBL21(DE3)(含pET．28a(+)．wC鼬。

5、访B1瞅e)成功表达wcRi。访B·Ⅱk。蛋白且目的蛋白分子量约为20kDa，其纯度已达93．4％以上。2、VVC胝mB1船无溶血活性。3、VVC剐。访B1妇对HeLa细胞具有细胞毒性：VVCRi。协B1诙。作用于HeLa细胞后，细胞凋亡率明显增大，HeLa细胞线粒体膜电位逐渐下降，细胞内活性氧水平亦逐渐增加。4、成功制备VVC砌啪B1妇多克隆抗体。5、免疫印迹分析结果显示多克隆抗体能够特异性识别VVCm。inB1撤。抗原且具有较好的免疫反应性，ELISA测定抗体效价为1：3200。温州医学院硕士学位论文6、多克隆抗体能够成功阻断WC胝讯B

6、1ih对HeLa细胞的细胞毒活性。结论：WC黜。访B1她无溶血活性；VVC硒cinBl妇对HeLa细胞具有细胞毒活性；蛋白作用于HeLa细胞后，细胞凋亡率显著增大，线粒体膜电位逐渐下降及细胞内活性氧(ROS)明显升高；同时蛋白的细胞毒活性能被其相应抗体成功阻断。此段序列与创伤弧茵溶细胞素细胞毒活性相关，可能是溶细胞素发挥细胞毒活性的重要功能模序之一。关键词：创伤弧菌；溶细胞素；类蓖麻毒素模序；多克隆抗体；凋亡；JC．1；ROS温州医学院硕士学位论文Studyonthecelltoxicityofthelectin·-likedomainof

7、rvvhAObjectiveABSTRACT1．Thelectin-likedomainofrecombinantvibriovulnifiCUShemolysin(rvvhh)wasexpressed，purifiedandrenaturation．2．TocortfkrmwhethervVC黜。证B1垃。1娜hemolysisactivh3．Toclarifythemechanismofeellto．cityofthelectin-likedomainofrvvhA．4．Tostudytheblockingeffectofthedama

8、geofHeLacellsactedbyrabbitantibodyagainstVVC硒。iIlBI妇．Methods1．Inducedtheexpressionvectorp