新型筛选标记的烟草叶绿体转化载体构建

《新型筛选标记的烟草叶绿体转化载体构建》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、安徽农业大学硕士学位论文新型筛选标记的烟草叶绿体转化载体构建姓名：洪登华申请学位级别：硕士专业：生物物理学指导教师：范军20080601摘要叶绿体基因组转化的筛选标记多为抗生素抗性基因，它们虽然高效，但存在不少缺点。四吡咯分子如血红素、叶绿素和西罗血红素是植物重要的功能分子，其合成一些关键酶的编码基因，如编码谷氨酸半醛转氨酶的基因作为植物转基因的安全标记，根据转基因后代的白化性状，进行高效筛选，而尿卟啉原甲基化酶是一种新型红色荧光蛋白，但是，在植物中的应用还没有报道。目前，烟草质体转化的技术最为成熟，本研究主要构建烟草叶绿体转化载体，将大肠杆菌编码谷氨酸半醛转氨酶的基因hemL作

2、为筛选标记，玉米编码尿卟啉原甲基化酶的基因cobA作为荧光报告基因，利用同源重组片段trnI／trnA构建烟草叶绿体遗传转化的表达载体。本实验结果如下：1．采用改进的高盐低pH法提取烟草叶绿体基因组DNA，基因组大小为23kb，OD260：OD280值均在1．8~2．0范围内，提取的叶绿体基因组质量很高。2．根据NCBI公布的烟草同源重组蛋白trnI／trnA、质体核搪体(16S)RNA操纵元启动子腑z和质体psbA基因3’端psbA3序列，以烟草叶绿体基因组为模板，PCR扩增出trnI／trnA、胁z、psbA3’的特异DNA片段，扩增片段测序结果：trnl基因长度为969bp

3、，trnA基因长度为883bp，P，仰基因长度为144bp，psbA3，基因长度为508bp，与烟草叶绿体基因组公布的序列进行对比分析，同源性较高。3．根据公布的hemL和cobA序列，分别以大肠杆菌谷氨酸半醛转氨酶基因GSAT的重组质粒和玉米尿卟啉原甲基化酶SUMT的重组质粒为模板，PCR扩增出hemL和cobA特异片段。扩增片段测序结果：hemL基因长度为1288bp，cobA基因长度为846bp。与公布的序列进行对比分析，同源性为100％。4．分别用相应的限制性内切酶消化相应的重组质粒，回收外源片段，根据pBluescriptSK+多克隆位点和顺序，按差异性位点将外源片断依

4、次插入到pBluescriptSK+中，构建了烟草新型叶绿体表达载体pBSK—TPTCPhemL，序列为：棚h胁z_R&孓_÷JIlP，比一R8．譬_∞枷_易，柏3’一f门叫。用Hin铘酶切pBSK-TPTCPhemL载体，琼脂糖凝胶电泳检测大小为7000bp左右，说明构建的载体大小正确。综上所述，本文成功克隆了编码烟草叶绿体表达载体的基因片段，并构建了烟草表达载体，为进一步研究这两个基因作为叶绿体转化的筛选基因和标记基因、建立安全高效的叶绿体转化体系和生物反应器技术奠定基础，在作物遗传育种改良方面具有广阔的应用前景。关键词：叶绿体转化载体构建四吡咯分子合成烟草AbstractS

5、everalgenesencodingtheenzymesthatdecomposetheantibioticsareapplied嬲theselectingmarkersofchloroplasttransformation．Theydisplayefficientinthescreenoftransienceplants，However,thesegeneshavesevsraldisadvantages．Non—antibioticgeneshavebeenappliedinrecentyears．Amongthem，somegenesencodetheenzymesinv

6、olvedinthebiosynthesisofplanttetrapyrrolesincludinghemes，chlorophyllsandsiroheme，whichareimportantforplantgrowth．Thegeneencodingglutamatesemialdehydeaminotransferaseisusedasthehighefficientscreenmarkersincetheoffspringsplantwithoutthemarkerproducealbinoseedlings．Uroporphyrinogenmethyltransfer

7、aseisanovelredfluorescentindicatorsinbacteria，fungiandmammaliancells，butitsapplicationinplantsisneededtofurtherstudy．Tobaccoiswidelyusedasthemodelforchloroplasttransformationduetohighefficiency．Inthisstudy,weconstructedthechloroplasttransform