线粒体遗传转化与筛选标记分析

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2、,昂U本和电子版，并采用影印、缩印、扫描、数字化或其它手段保存论文；学校有权提供目录检索以及提供本学位论文全文或者部分的阅览服务；学校有权按有关规定向国家有关部门或者机构送交论文的复印件和电子版；在不以赢利为目的的前提下，学校可以适当复制论文的部分或全部内容用于学术活动。学位论文作者签名：世乒噶为Ⅻ尸年，月彤日经指导教师同意，本学位论文属于保密，在年解密后适用本授权书。指导教师签名：学位论文作者签名：解密时间：年月日各密级的最长保密年限及书写格式规定如下：r———————～————⋯——————]}内部5年(最长5年，可少于5年){；秘密★10年(最长1

3、0年，可少于10年)；ij机密★20年(最长20年，可少于20年)o一一．，。．。～，—⋯⋯。，—．?⋯，—。—。⋯，⋯～～．⋯。．—，．——一。．⋯．。，，——⋯⋯⋯—，．一⋯．，。⋯。?。。，，⋯～，jt第一章引言第一章引言线粒体(mitochondria)是真核生物细胞中广泛存在的重要细胞器之一，它不但是真核细胞进行呼吸氧化产生ATP的主要场所，而且还执行着三羧酸循环、电子传递、氧化磷酸化及脂肪酸的生物合成等职能。自1963年M．Nass及S．Nass发现线粒体DNA以来【1】，对线粒体的结构、功能等多方面进行的大量研究表明，线粒体在能量代谢、细胞

4、质遗传、线粒体基因表达调控、线粒体与细胞核的相互作用、信号转导以及细胞凋亡等生命活动中具有重要作用。线粒体是半自主性细胞器，含有自己的基因组DNA(mitochondrialDNA，mtDNA)，因此可以通过构建适当的线粒体表达载体，大量生产外源蛋白。尽管核基因转化技术已经很成熟，但到目前为止，线粒体的遗传转化始终没有形成一套常规的体系和方法。因此，这一新领域的相关研究不仅在理论上极大地丰富了有关线粒体的研究，并且为细胞器转化、构建新型的生物反应器(bioreactor)以及线粒体相关疾病的基因治疗奠定了坚实的基础。第一节线粒体基因组的特点1．1．1线粒

5、体主基因组线粒体是半自主性细胞器，含有自己的基因组DNA(mitochondrialDNA，mtDNA)，可以编码细胞器的一些蛋白质。除少数低等真核生物(如衣藻和四膜虫)的线粒体基因组为线性双链分子外【2'3】，大多数线粒体基因组为双链超螺旋闭合环状分子。每个细胞中存在着多个线粒体，并且一个线粒体里也有多份基因组拷贝，因此不同物种的线粒体基因组大小相差悬殊。哺乳动物的线粒体基因组较小，约为16．6kb；酵母的线粒体基因组约为84kb；植物的线粒体基因组最大。在已知的高等植物中，白芥(Brassicahirta)的线粒体基因组最小，约为218kb；甜瓜(C

6、ucumismelo)的线粒体基因组最大，约为2300kbl4]。线粒体DNA含有大量信息，如rRNAs，tRNAs和蛋白质。细胞色素b、细胞色素氧化酶及ATP酶等亚基的mRNA是在线粒体中合成并保留在其中，由线第一章引言粒体所含有的核糖体进行翻译，合成蛋白质。在线粒体的核糖体中有两类rRNA分子，它们也是由mtDNA编码。线粒体基因组能够单独进行复制、转录及合成蛋白质，但这并不意味着线粒体基因组的遗传完全不受核基因的控制，线粒体自身结构和生命活动都需要核基因的参与并受其控制。这说明真核细胞内尽管存在两个遗传系统，各自合成一部分蛋白质和基因产物，形成细胞

7、核和细胞质之间的遗传相互作用，但是核基因在生物体的遗传控制中仍然起主宰作用。哺乳动物线粒体基因组DNA没有内含子，几乎每一对核苷酸都参与一个基因的组成，并非每个基因都有自己的启动子，因此具有明显的原核生物性质。植物细胞的线粒体基因组大部分由非编码的DNA序列组成，且有许多短的同源序列。这些同源序列之间的DNA重组会产生较小的亚基因组环状DNA，与完整的主基因组共存于细胞内【5~㈣。因此，对植物线粒体基因组的研究更为困难。由于真核生物雄配子的细胞质极少，子代的mtDNA基本上都是来自雌配子细胞，因此一般认为，mtDNA是母性遗传(maternalinher

8、itance)的。但是，近年来PCR及杂交实验结果证实，一些动物(如小鼠)及高等