杜氏盐藻ccap1918叶绿体转化载体的构建及转化

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1、郑州大学硕士学位论文杜氏盐藻CCAP19/18叶绿体转化载体的构建及转化姓名：张汇征申请学位级别：硕士专业：免疫学指导教师：潘卫东201204摘要杜氏盐藻CCAPl9／18叶绿体转化载体的构建及转化近年来，藻类作为一种新的生物反应器得到重视，相对于已有的大肠杆菌、酵母、转基因动植物系统而言，具有生长迅速、培养简单、易于遗传操作、成本低廉等特点，受到了人们的青睐。其中盐藻是迄今已知最耐盐的单细胞真核绿藻，可在0．05．5．5MNacl中生长，是适合大规模开放式培养的理想微藻。目前，模式生物衣藻的转基因研究已趋于成熟，作为衣藻的近缘藻，盐藻的转基因研究也在逐

2、步进展，已有多种蛋白在盐藻核系统中表达。随着核转化系统研究不断深入，也发现了一些至今尚未解决的难题：表达量低、基因组大且背景复杂、外源基因转入后易出现失活、沉默和位置效应、在其内表达原核基因必先经修饰改造、环境安全问题等易发生，叶绿体转化系统因其定点整合，可人为控制其插入位点，从而很好地解决了核转化后“基因失活”、“位置效应”等问题。而叶绿体DNA分子的多拷贝及多顺反子的表达形式，可使外源基因由共同的启动子控制，不仅操作简便而且避免了“共沉默”现象，还对外源性表达产物的积累拥有较高的耐受能力，为外源基因的在其系统的高效表达提供了保障。其母系遗传的特点也使

3、其具有较高的生物安全性，因此叶绿体转化成为盐藻转化的一个重要方向。叶绿体转化的关键是构建能够定点整合的表达载体，必须有适宜的同源序列和插入位点。杜氏盐藻CCAPl9／18的叶绿体基因全序列已测定完毕(Genbank号：GQ250046．1，全长269044bp)，为建立盐藻的叶绿体转化系统提供了极大的便利。本文选取chiN基因作为同源片段，将外源基因插入其内。ehlN基因与chlB、chlL一起编码光非依赖的原叶绿素酸酯还原酶，任一破坏均可阻断叶绿素在黑暗条件的合成，但藻类可通过光依赖的原叶绿素酸酯还原酶合成叶绿素，不影响其生存。通过密度梯度离心法分离杜

4、氏盐藻完整叶绿体，提取叶绿体DNA，作为模板，设计引物采用PCR法扩增获得了chlN目的片段1622bp。以chiN基因片段摘要为同源片段，以aptA基因的启动子和rbcL基因的终止子为调控元件，以氯霉素乙酰转移酶基因(cat)为筛选标记，构建了杜氏盐藻叶绿体表达载体pchlNl622．CAT，在25心、0．8kV条件下通过电击法转入野生型杜氏盐藻中。为实现叶绿体的稳定转化，必须有适宜的选择压力，有效地杀死未转入外源基因和未有效整合的藻株，并使转入整合的外源基因顺利地实现同质化。本实验针对杜氏盐藻CCAPl9／18，对各类常用抗生素的敏感性进行了筛选，并

5、对其敏感的氯霉素进行了粗筛和细选，最终确定CCAPl9／18叶绿体转化的氯霉素选择浓度为300}tg／ml。结果表明：通过电击法将载体pUC．chlNl622．CAT转入CCAPl9／18叶绿体中，在300肛g／ml的选择压力下，野生藻在7．8天死亡，而转化藻则继续生长，PCR扩增鉴定表明CAT基因已整合入CCAPl9／18叶绿体基因组中。关键词：杜氏盐藻CCAPl9／18叶绿体转化catIIAbstractConstructionoftransformationvectorpchlN-．CAT-BARforchloroplastofDunaliella

6、salinaIIltherecentyears．asanewkindoftransgenicbioreactor，themicroalgaehavereceivedconsiderableattentionandbeengettingmorefavorjustbecausetheiradventagessuchasfewergrowthtime,lowercostofproductionandbeingeasierfortransgcnicmanipulationcomparedtootherexpressionsystemssuchasescheric

7、hiacoli，yeast，transgenicanimalsandplants．Dunaliellasalinaisaunicellular,halophilicgreenalgabelongingtoheClorophyceae，andamongthemostimportantlysalttolerantmicroalgae．Itcansurvivein0．05．5．5MNaCl，andissuitableforlarge—scaleopenculture．Presently，theresearchontransgenicmodelorganisms

8、suchasChlamydomonashasalreadybecomemorea