钝顶螺旋藻表达载体的构建及转化研究

《钝顶螺旋藻表达载体的构建及转化研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、安徽农业大学硕士学位论文钝顶螺旋藻表达载体的构建及转化研究姓名：王芬申请学位级别：硕士专业：微生物学指导教师：唐欣昀20080601摘要本文研究螺旋藻对刀豆氨酸(CS)和不同抗生素的耐受性和敏感性；提取螺旋藻抗CS突变株A9c的基因组DNA转化野生藻株A9，获得同源转化螺旋藻的参数组合；构建含有螺旋藻A9启动子的外源质粒载体p215t．spp，并将其转入螺旋藻A9，实现绿色荧光蛋白GFP在螺旋藻细胞内的稳定表达。本研究初步建立了一套螺旋藻遗传转化操作系统，可为螺旋藻转基因操作提供重要技术参考。Chl、Str对螺旋藻均有很强的抑制作用，在液体培养条件下，1．0

2、岭-ml卅的Chl、31xg·ml“的Str对螺旋藻有完全的致死作用；固体培养条件下，1．299·ml。的Chl、499·mlq的Str可完全抑制螺旋藻在固体平板上的生长。Amp对螺旋藻有较强抑制作用，液体培养时Amp对螺旋藻的MIC为100txg·ml～；固体培养时Amp对螺旋藻的MIC约为200}tg·ml～。螺旋藻对Km很不敏感，在60099tml_Km的液体培养基中，螺旋藻的生长完全不受抑制。Chl、Str和Amp均适合作为螺旋藻的抗性筛选标记，筛选浓度分别为：1．299‘ml一、4txg’ml～、200}tg’ml～。将螺旋藻抗CS突变株A9c的基

3、因组DNA作为材料转化野生藻株A9，以30}tg·ml‘1的CS作为筛选压力，获得了转化藻株，得到了一些同源转化的参数：在低于最适生长温度的条件下(24℃)培养螺旋藻；转化前用2mmol·L。的EDTA预处理24h；利用超声波对螺旋藻进行处理，功率为300w，处理时间为70s；采用自然转化方法，冰浴处理，避光条件下液体培养后涂平板，筛选转化子。本实验以构建的携带gyp基因的质粒p215t．spp和出发质粒p215t作为载体，分别采用冰浴法和PEG融合法转化螺旋藻A9藻株，成功实现了gyp基因在螺旋藻株中的表达。比较了用不同质粒在相同条件下转化A9藻株的转化率

4、，数据显示p215t．spp可以比p215t极显著提高转化率(cc=0．01)，初步证明采用螺旋藻的启动子构建质粒可以提高转化效果；比较了相同质粒用不同方法转化A9藻株的转化率，数据显示采用适当浓度的PEG可以有效的提高转化率。经过反复实验证明，采用1％的PEG浓度作用30min可以获得较高转化率(10．5‰)。对转化藻株进行荧光检测，藻丝段在390nm蓝光激发下发出绿色荧光，证实gYp基因在转化藻株中得到有效表达。连续观察转化藻株荧光发光情况发现，转化藻株转接3次后均可观察到绿色荧光，证明了咖基因成功实现了在螺旋藻细胞内的稳定表达。关键词：螺旋藻载体构建g

5、yp基因PEG法转化率绿色荧光AbstractInthispaper，thetoleranceandsensitivitiesofSpirulinatodifferentantibioticsandL--canavaninesulphate(CS)wasexpounded．Intheexperiment，weextractedDNAanti-CSmutantA9candtransformeditintoA9strain，thenweacceptedsomeparameterstotransformSpirulina．Also，weconstructedthe

6、foreignvectorp215t—sppwhichcontainsSpirulinapromoterA9，andtransformeditintoSpirulinapromoterA9．Thus，GreenFluorescentProtein(GFP)expressedsuccessfullyandstablyinSpirulina．ThisresearchestablishedasystemforgenetictransformationoperationofSpirulina，andprovidedimportantreferencetotrans—

7、genetechnologyofSpirulina．SpirulinawasextremelysensitivetoantibioticssuchasChlandStr．ThelethalconcentrationofChlandStrwere1．Olxg‘ml～and31xg。ml。1inliquidcultivatingand1．21xg‘ml～and4p,g‘ml。‘insolidcultivatingrespectively．TheSpirulinawasrelativelysensitivetoAmp．Theminimuminhibitorycon

8、centration(MIC)ofAmpwaslOO