食管鳞癌甲基化谱和表达谱的联合分析及早期诊断标志物的筛选

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南方医科大学2011级博士学位论文食管鳞癌甲基化谱和表达谱的联合分析及早期诊断标志物的筛选Combinationanalysisofmethylomeandtranscripomeofesophagealsqumouscellcarcinomaandidentificationofpotentialepigeneticbiomarkersforearlydiagnosis课题来源：自选学位申请人导师姓名专业名称培养类型培养层次所在学院李许锋张积仁教授；郑燕芳教授肿瘤学学术型博士第二临床医学院答辩委员会主席陈尊器教授答辩委员会委员廖旺军教授汪森明教授张为民教授张秀萍教授2014年5月10日广州 博士学位论文食管鳞癌甲基化谱和表达谱的联合分析及早期诊断标志物的筛选博士研究生：李许锋指导教师：张积仁教授；郑燕芳教授摘要研究背景：食管癌(esophagealcancer，Ec)也叫食道癌，是食管粘膜上皮及食管腺上皮的恶性肿瘤，主要有两种不同的临床病理类型：食管鳞癌(esophagealsquamouscellcarcinoma，ESCC)和食管腺癌(esophagealadenocarcinoma，EAC)，两种病理类型的肿瘤的发病机制和病理转归各不相同。在全球范围内，食管癌发病率和死亡率分别位于恶性肿瘤的第9位和第8位。国际癌症研究中心(IARC)全球统计报告显示：2008年在世界范围内食管癌的新发病例为482，300例，因食管癌死亡的病例为406，800例。食管癌的分布呈现地域性分布特征，伊朗北部穿越中亚共和国到中国北方，这一区域被称为“食管癌地带”，其中90％的病理类型为鳞状细胞癌。2008年，中国大陆13．4亿人口食管癌新发25．9万例，发病率为16．7／10万，居全国各类恶性肿瘤第5位：死亡21．1万例，死亡率为13．4／lO万，居第4位。按性别统计，我国男性食管癌患者17．6万，发病率为22．9／10万；死亡14．4万，死亡率18．7／10万；女性患者8．3万，发病率为10．5／10万，死亡6．77i，死亡率8．2／10万，男性发病率居各类恶性肿瘤第4位，女性居第7位，而死亡率男女均居第4位。我国食管癌的典型流行病学特征表现为明显的地区差异，局部地区的高发和其周边地区的相对低发形成鲜明的对比。食管癌在太行山脉附近的省份高发，河南省林州市食管癌发病率最高，病理类型多为鳞癌。在我国，食管癌已成为危 摘要害人民群众生命安全的公共卫生问题，尤其是在食管癌高发地区。然而，食管鳞癌的发病原因尚未完全清楚。流行病学研究发现，热烫饮食、营养缺乏、食用酸菜和亚硝酸盐污染的食物、霉菌毒素、吸烟饮酒等在食管鳞癌的发病中起重要作用。然而，只有部分暴露在这些环境的个体最终发生食管鳞癌：另外，在我国食管鳞癌的高发地区，食管鳞癌的发病呈现出家族聚集现象。这些现象说明除了环境因素外，遗传因素在食管鳞癌的发病中也同样起着重要作用。因此揭示食管鳞癌发病的内在遗传分子机制是一个迫切需要解决的问题。除了遗传学因素外，表观遗传学异常改变(尤其是DNA甲基化)在食管鳞癌的发病中同样扮演了重要角色，所以，揭示食管鳞癌的DNA甲基化特征并将其研究结果转化为临床应用显得非常必要。手术治疗是食管鳞癌的主要有效治疗手段之一，食管鳞癌早期没有特异性的临床表现，因此食管鳞癌在就诊时往往已是中晚期，相当部分病人已经失去了手术治疗机会，其5年生存率不至UlO％。但是，早期诊断的食管鳞癌手术治疗的5年生存率可达到95％。早期发现是决定食管鳞癌5年生存率的重要因素。研究发现，早期癌变即可引起甲基化异常改变，并且DNA甲基化变异可以在体液和早期病变活检组织中检测到，另外，DNA甲基化可以通过去甲基化药物干预逆转，提示基因的甲基化异常可能作为早期发现食管癌变和治疗干预的生物靶点。本课题应用高通量的llluminamethylation450Karray技术，揭示了食管鳞癌的DNA甲基化组学特征，并且对食管鳞癌的DNA甲基化谱和表达谱联合分析，发现了168个潜在的功能性甲基化异常基因，进一步在分子层面认识食管鳞癌的发生、发展。另外，我们从发现的潜在的功能性甲基化基因中挑选2个基因进行了放大样本量的验证，并且评价了它们在血浆中的甲基化对食管鳞癌的诊断价值。本研究分为三个章节：第一章：目的：分析食管鳞癌的DNA甲基化组学特征。方法：利用Illuminamethylation450Karray技术，全基因组扫描食管鳞癌组织和对照正常食管粘Il 博士学位论文膜组织的DNA甲基化。将芯片原始数据导入BRB-arrayTool(4．3．2version)进行数据分析。结果：甲基化芯片原始数据聚类分析和多维尺度分析说明，食管鳞癌和正常组织存在差异。G0富集分析发现252基因集在食管鳞癌和正常组织之间存在差异，BiocartaPathway和KEGGPathway富集分析发现74个信号通路在食管鳞癌和正常组织之间存在差异。结论：食管鳞癌的DNA甲基化与正常食管粘膜组织存在差异，DNA异常甲基化可能在食管鳞癌的发生、发展中起着重要作用。第二章：目的：筛选出可能调控基因表达的DNA甲基化基因。方法：对食管鳞癌甲基化谱和表达谱联合分析，找出方向变化不一致的差异基因(比如，超甲基化的基因同时基因表达下调，去甲基化基因同时表达上调)。将基因导入DAVID在线分析工具(DAVIDBioinformaticsResources6．7)进行信号通路分析。结果：通过甲基化谱和表达谱的联合分析，发现168个基因的甲基化改变与表达变化方向相反。‘KEGG信号通路分析，发现这些基因参与了多个肿瘤相关信号通路。结论：食管鳞癌中DNA异常甲基化可能影响多个肿瘤相关信号通路基因，这些异常的DNA甲基化基因可能共同参与了食管鳞癌的发生、发展。进一步揭示了食管鳞癌是_个多基因异常的疾病。第三章：目的：检测EPPB41L3，GPX3在肿瘤组织及血浆中的甲基化频率差异，并且评价其对食管鳞癌的诊断价值。方法：收集食管鳞癌组织(n=42例)及癌旁组织(n：42例)，食管鳞癌患者血浆(n=42例)和健康志愿者的血浆(n=50例)。应用甲基化特异性PCR(MSP)结合琼脂糖凝胶电泳检测EPB41L3，GPX3在组织和血浆中的甲基化状态。将实验结果录入SPSS20．0统计软件，计数资料两组间比较采用x2检验进行统计分析；用受试者工作特征曲线(ROCcurve)分析血浆中EPB41L3与GPX3甲基化对食管鳞癌的诊断价值。结果：EPB41L3在肿瘤组织中的甲基化频率为59．5％，显著高于癌旁组织4．8％，差异有统计学意义(x2=28．873，P<0．001，n=84)。GPX3在肿瘤组织的甲基化频率为54．8％，癌旁组织III 摘要为9．5％，差异有统计学意义(X2=19．704，P<0．001，n=84)。EPB41L3在肿瘤患者血浆中的甲基化频率为31．o％，GPX3在肿瘤患者血浆中的甲基化频率为40．5％，二者在健康志愿者的血浆中没有检测到甲基化。受试者工作特征曲线(ROCcurve)分析发现，血浆中二者联合敏感性为57．1％，特异性100％，AUC=0．786(95％CIO．685—0．886)。结论：EPB41L3，GPX3在食管鳞癌组织和患者血浆中的甲基化频率高于癌旁组织和健康志愿者血浆的甲基化频率。联合检测能够提高敏感性同时不影响特异性。关键词：食管鳞癌；甲基化谱；表达谱；DNA甲基化标志物：早期诊断。IV 博士学位论文CombinationanalysisofmethylomeandtranscripomeofesophagealsqumouscellcarcinomaandidentificationofpotentialepigeneticbiomarkersforearlydiagnosisName：liXuFengSupervisor：Prof．ZhangJiRenandProf．ZhengYanFangABSTRACTEsophagealcancer(EC)isamalignantdiseaseofesophagealmucosaandesophagealepithelial．Therearetwodifferenttypesofhistopathology：esophagealsquarnouscellcarcinoma(ESCC)andesophagealadenocarcinoma(EAC)．Tumorpathogenesisandpathologicaloutcomesoftwodifferenttypesofhistopathologyaredifferent．Wordwide，theincidenceandmortalityoftheesophagealcancel"aretheninthandtheeighthinallthemalignanttumors．TheglobalstatisticalreportofInternationalAgencyforResearchonCancer(L4LRC)showsthatallestimated482，300RCWesophagealCanCercasesand406，800deathsoccurredin2008worldwide．Thecharacteristicaldistributionofesophagealcartcerisregionaldistribution．StretchingfromnorthernIranthroughthecentralAsianrepublicstoNorth-CentralChina，oftenreferredtoasthe“esophagealCanCerbelt,’’90％ofcasesarcsquamouscellcarcinomas．Intheyear2008，inChinathereare259，000newcascsofesophagealcancerofthe1．34billionChinesemainlandpopulation．Theincidencerateofesophagealcanceris16．7／104whichranksthefifthinalltypesofCanCer．211，000deathsOccurduetoesophagealCanCel"andthemortalityrateis13．4／104whichranksthefourthin alltypesofcancer．Thereare176，000newmaleesophagealcancerpatientsand144,000deaths，theincidenceis22．9／104andthemoralityrateis18．7／104ofmale,thereago83，000newfemaleesophagealcancerpatientsand67，000deaths，theincidenceis10．5／104andthemortalityrateis8．2／104offemale．Theincidenceofesophagealcancerofmaleisthefourthinthemalignanttumorsandtheincidenceofesophagealofcanceroffemaleistheseventhinthemalignanttunlors．Boththemortalityrateofesophagealcancerofmaleandfemalearethefourthinthemalignantturflor$．InChina,thetypicalepidemiologicalcharacteristicofesophagealCanCeristhedifferencebetweendifferentareas．Theincidenceofesophagealcancel"issharplyhigherinthecenterareacontrasttothesurroundingareas．TheincidenceofesophagealcancerishigherinprovincesnearbytheTaihangMountainsandLinzhoucountryhasthehighestincidenceofesophagealcancerinChina．Therefor,inourcont巧esophagealcancerhasbecomeapublichealthyproblemwhichendangerpeople’Shealthandlives，particularlyintheareasinwhichtheincidenceofesophagealcancerishigher．However,theetiologyofesophagealsquamouscellcarcinomaisnotyetfullyunderstood．Epidemiologicalstudieshavefoundthatunblanchingdiet，nutritionaldeficiencies，drinkingbeveragesathightemperatures，eatingsauerkrautandnitritecontaminationfood，mycotoxins，smoking,drinkingplayimportantrolesinthepathogenesisofesophagealsquamouscellcarcinoma．Nevertheless，onlyafewpartofindividualswhoesposcdtothesallleriskfactorsbecomeesophagealsquamouscellcarcinomapatients．Inaddition，intheareasofhi【ghindigenceofesophagealsquamouscellcarcinoma,theincidenceofesophagealsquamouscellcarcinomaexhibitsfamilialaggregation．Thesephenomenaarguethatthereisaninteractionofenvironmentalfactorsandgeneticfactorsandbothofthemplayimportantrolesinthepathogenesisofesophagealsquamouscellcarcinoma．Therefor,itisimperativetofurtherunderstandtheunderlyingmolecularmechanismofesophagealsquamouscellcarcinoma．Inadditiontogeneticfactors，epigenctics(especiallyDNAmethylation)alsopalyanimportantroleinthepathogenesisofesophagealsquamouscellcarcinoma．Importantly,epigeneticchanges，includingalterationsinDNA 博士学位论文methylation，alereversibleandCanthusbetargetsforcancertherapyorchcmoprevention．Therefore，abetterunderstandingoftheDNAmethylationinesophagealsquamouscellcarcinomaisimportantforoptimizingCanCertherapyandchemoprevention．Surgeryisoneofthemaineffectivemeansoftreatmentforesophagealsquarnouscellcarcinoma．Despitesignificantadvancesindiagnosisandtreatmentofesophagealsquamouscellcarcinoma,thefiveyearsurvivalrateisstillabout10％becauseofitsasymptomaticprogressionintheearlystage．Themajorityofesophagealsquamouscellcarcinomapatientshasadvancedmetastaticdiseaseatinitialdiagnosisandisinappropriateforcurativeresection．Insharpcontrast,thefive-yearsurvivalrateforESCCpatientswiⅡlendoscopicmucosectomyatearlystages,i．e．carcinomainsituandintramucosalcarcinoma,W&q100％afterendoscopicmucosectomy,andsurgerygivesanoverallfive-yearsurvivalrateof90％．Earlydiagnosisisanimportantfactorindetermining5-yearsurvivalrateofesophagealsquamouscellcarcinoma．TheresearchreportsthatintheeralystageofthecancerthereisalterationofDNAmethylationandtheseabnormalDNAmethylationscanbedetectedinbodyfluidsandearlylesionbiopsies．What’Smore，DNAmethylationcanberestoredbydemethylatingagent,suggestingthatabnormalDNAmethylationmaybeasbiomarkersforearlydiagnosisandtargetsofbiologicaltargettherapy．Inthecurrentstudy,weanalyzedglobalmethylationprofilingofesophagealsquamouscellcarcinomaandnormaladjacenttissueinChinesecancerpatientsandesophagealmucosafromChinesehealthyindividuals，usingInfiniumMethylation450Karray．AfteranalysisofthemethylationdifferencesandthenincombinationwithindependentgeneexpressiondatausingBRB(BiometricsResearchBranch)一ArrayToolsoftheNationalCancerInstitute,asetofgenesthatarederegulatedbyaberrantDNAmethylationinesophagealsquamouscellcarcinomaWasidentified．Wcthenfocused0n2aberrantDNAmethylationge鹋s_EPB41L3andGPX3．wi廿lvalidationanalysisusingadditionalesophagealsquamouscellcarcinomatissuesandadjacentnormaltissues．Inordertoevaluatewhetherthemethylationstatusofthe2candidategenesisusefulfordiagnosingESCC，wealso testedthemenhylationofthecirculatingcell-freeDNAinpatients’plasmaandcontrols．Ourresearchincludingthreeparts：Thefirstpart：Objective：ToanalyzethewholeDNAmethylomeofesophagealsquamouscellcarcinomainChinesepatients．Methods：WeanalyzedglobalmethylationprofilingofesophagealsquamouscellcarcinomatissueandnormaladjacenttissueinChinesecancel"patientsandesophagealmucosafromC1linesehealthyvolunteers，usingInfmiumMethylation450Karray．WeimportedthechiprawdataintoBRB-arrayTool(4．3．2version)fordataanalysis．Results：Methylationchiprawdataclusteringanalysisandmultidimensionalscalinganalysisshowedthatthe2mainclusterswereeachcomposedbyaphenotype：tunAorandnormal．Differenceanalysisofgenesetsfoundthatmultiplesignalingpathwaysaresignificantlydifferencebetweenesophagealsquamouscellcarcinomaandcontrolnormalesophagealmucesa．Conclusion：EsophagealsquamouscellcarcinomaandnormalesophagealmucosahaveadifferentDNAmethylationpattern．DNAmethylationabnormalitiesmayplayanimportantroleinthetumorigenesisofesophagealsquamouscellcarcinoma．Thesecondpart：objective：Tosc're圮nthepotentialfunctionalDNAmethylationgeneswhichmaypossibleregulategeneexpression．Methods：WecombinatedanalysisofmethylomeandtranscriptomeofesophagealsquamouscellcarcinomausingBRB-arrayToolandonlineVennyanalysistoidentifyDNAmethylationthatmayhavefunctionalconsequencesinesophagealsquamouscellcarcinalmadevelopmentandprogression．WefurtheridentifiedthepathwayofthesegenesusingDAVID(DatabaseforAnnotation，Visualization，andIntegratedDiscoveryv6．7)onlinebioinformaticsanalysis．Results：168genesshowedinversecorrelationbe撕eenDNAmethylationandexpressionchange．(e．g．decreasedexpressionwithincreasedmethylation，andvice-versa)．KEGGsignalingpathwayanalysisfoundthatthesegenesareinvolvedinseveralcancer-relatedsignalingpathways．Conclusion：AbnormalDNAmethylationmayaffectmultipletumor-associatedsignalingpathwaysandtheseabnormalDNAmethylationsofgenesmaybeinvolvedinthe 博士学位论文developmentandprogressionofesophagealsquamouscellcarcinoma．Theseresultsuggestedthatesophagealsquamouscellcarcinomaisamalignantdiseasewhichinvolvedmanyabnormalgenes．Thethirdpart：Objective：TodetectEPPB41L3，GPX3methylationfrequencybetweenHnllortissuesandcontrolnormaltissues，betweenesophagealsquamouscellcarcinomapatients’plasmaandhealthyvolenteers’plasma,andtoevaluatethediagnosticvalueoftheEPB41L3，GPX3methylationstatusintheplasmaforesophagealsquamouscellcarcinoma．Methods：Wecollectedesophagealsquamouscellcarcinomatissues(n=42cases)andadjacentsurroundingnormaltissues(n=42cases)，plasmaoftheesophagealsquamouscellcarcinoma(n=42cases)andplasmaofthehealthyindividuals(n=50eases)．WeusedMethylationspecificPCR(MSP)combined谢饿agarosegeleleetrophoresistodetectthemethylationstatusoftheEPB41L3，GPX3．WeusedSPSS13．0softwareforstatisticalanalysisbyftestandFisher'sexacttest．Results：EPB41L3frequencyofmethylationintumortissueWas59．5％．significantlyhigherthantheadjacenttissueswhichWas4．8％，thedifferenceWasstatisticallysignificant(矛=28．873，P／500ng)仪器：Thermocycler，96孔skirtedmicroplate(0．2m1)准备工作：1．根据试剂盒的操作要求准备conversionreagent，注意避光，现配现用；2．根据试剂盒的操作要求准备washbuffer；实验操作：1．将每个新96孔skirtedmicroplate(0．2m1)粘贴BCDbarcodelabel做标2．根据EZDNAMethylationKit要求，将基因组DNA变性，然后力Rfl．conversionreagent；3．Thermocycler中过夜孵育，以下条件下，16个循环：95℃30秒50℃1小时4℃forever第二天：(Pre—A胛)制备BCD：试剂：ZymoEZDNAMethylationkit(includesbisulfate—conversionreagent，dilutionbuffer，desulphonationbuffer，elutionbuffer)仪器：Thermocycler，96孔skirtedmicroplate(0．2m1)实验操作：1．根据试剂盒操作要求 第一章：食管鳞癌的DNA甲基化特征分析／洗涤去除conversionreagent；／室温下desulphonationbuffer中孵育15分钟：／洗涤去除desulphonationbuffer；／加入elutionbuffer；2．离心洗脱基因组DNA3．将亚硫氢酸盐处理的基因组DNA转移入BCDplate中4．封闭的BCD低温保存待用，一15℃至一25℃；制各MSA4：碱变性-基因组全扩增试剂：NaOH，MAI，RPM，MSM，亚硫氢酸盐处理的基因组DNA：仪器：杂交炉，新的MIDIplate，振荡器，室温离心机；准备工作：1．配置1MNaOH，分装后一20"C低温保存待用。每次使用前解冻，10倍稀释为0．1MNaOH；2．打开杂交炉，预热至37℃；3．取出MAl，RPM，MSM解冻，融为液体后280×g离心待用：取出亚硫氢酸盐处理的基因组DNA解冻实验操作：、1．将新MIDIplate粘贴MSA4barcodelabel做标记；2．20I|1MAl加入MSA4platewells；3．4u1亚硫氢酸盐处理的DNAsampleJJl入MSA4platewells，在labtrackingform上记录MSA4platewells中对应的样品ID：4．4u10．IMNaoH力IA．MSA4platewells，盖上96j：L板capmat(注意覆盖时的字母方向正确，盖紧，防止飞溅挥发和污染)；5．振荡器上1600rpm，混匀1分钟；离心机中280Xg离心1分钟；6．室温孵育，静置10分钟；7．68plRPM加入MSA4platewellS：8．75ulMSM加入MSA4platewells；1R 博士学位论文9．重新盖上capmat；10．将盖好的MSA4上下颠倒翻转至少lO次，充分混匀；11．离心机中280×g离心1分钟；12．杂交炉中孵育，37℃22d,时过夜(20一24小时)；第二天：(Post—AMP)断裂-沉淀一重悬一杂交：试剂：FMS，PMl，100％异丙醇，RAl，PB2，100％乙醇，XC4；仪器：杂交炉，振荡器，室温离心机，heatblock，4。离心机，tuberack，heatsealer，foilheatseal金属箔，芯片，HybChambers杂交盒，HybChambergaskets杂交盒衬垫，HybChamberinserts；断裂一．准备工作：1．打开heatblock，预热至37℃：2．取出FMS，RAl(晶体难溶解)解冻，融为液体后280×g离心待用；实验操作：1．取出MSA4，50xg离心1分钟；2．50Il1FMS加入MSA4platewells，重新盖上capmat；、3．振荡器上1600rpm，混匀1分钟；离心机中50×g离心1分钟：4．37℃heatblock中孵育1小时；5．以下步骤选择(1)继续实验(2)封闭的MSA4低温保存待用，一15℃至一25。C；沉淀二．准备工作：1．打开heatblock，预热至37。C：准备好4"C离心机待用2．取出PMl置于室温280×g离心待用，取出100％异丙醇；3．若是冻存的MSA4，则取出解冻，50×g离心；19 第一章：食管鳞癌的DNA甲基化特征分析实验操作：1．掀开MSA4的capmat，100ulPMl加)入．MSA4platewells，重新盖上；2．振荡器上1600rpm，混匀1分钟；3．37℃heatblock中孵育，5分钟；4．离心机中50×g离心1分钟；5．300u1100％异丙醇加入MSA4platewells，重新盖上新的干燥capmat)6．将盖好的MSA4上下颠倒翻转至少lO次，充分混匀；7．4℃冰箱孵育30分钟；8．4。C离心机中3，000×g离心20分钟；然后立即将MSA4取出离心机，弃除capmat，立即翻转去除上清液，水平倒扣在吸水纸上方轻叩至没有水印，时间约1分钟即可，不要使蓝色沉淀移动，MSA4一直保持倒扣状态。(若是离心结束后有时间延误未能及时去除上清，则需要重新离心20分钟)；9．MSA4保持倒扣状态放置于tuberack上，1小时空气干燥；10．以下步骤选择(1)继续实验(2)封闭好MSA4低温保存待用，一15℃至一25"C；重悬三．准备工作：1．打开杂交炉，预热至48℃；打开heatsealer：2．观察RAl是否透明，没有晶体存在；实验操作：1．46p1RAl加入MSA4platewells，RAl使用完毕即冻存；2．金属箔覆盖MSA4后，heatsealer下作用5秒，然后将MSA4上下顺序改变后再作用5秒，继而将金属箔稍微掀起验证封口的效果；3．将封口的MSA4放入48。C杂交炉，孵育l／J,时；4．振荡器上1800rpm，混匀1分钟：离心机中280×g离心1分钟；若是冻存的MSA4，则需要反复振荡离心直到蓝色沉淀彻底重悬： 博士学位论文5．以下步骤选择(1)继续实验(2)封闭的MSA4低温保存待用，一15。C至一25。C，若要超过24小时使用，则一80℃冻存；杂交三．准备工作：1．打开heatblock，预热至95"C：打开杂交炉，预热至48"C，调节转速为5；2．准备杂交盒，杂交盒衬垫，HybChamberinserts；实验操作：1．打开杂交盒，杂交盒衬垫放入杂交盒中，400ulPB22H入杂交盒上下小凹槽中(上下小凹槽对应一张芯片)，马上关闭杂交盒防止挥发，按照对角线方向扣住，室温放置待用；2．重悬后封口的MSA4，放入95。Cheatblock中变性20分钟：3．取出芯片放置室温，不要打开；4．变性后的MSA4室温冷却30分钟，然后离心机中280Xg离心1分钟：5．将芯片在盒中取出，小心将其取出包装，不能碰到芯片加样品的位置，对应barcode位置放于HybChamberinserts中：．6．15IllDNA样品按照芯片样品区顺序加入芯片加样区，注意缓缓流入过程中不要产生气泡，同时记录样品和芯片对应号；7．将带有芯片的HybChamberinserts对应barcode位置放于杂交盒中，关闭杂交盒；8．杂交炉中孵育，48。C18小时过夜(16—24小时)；9．330ml100％乙醇加入XC4中，剧烈混匀15秒，室温过夜待用；第三天：(Post—A押)洗涤一延伸一染色一扫描：试剂：PBl，RAl，XCl，XC2，TEM，XC3，STM，AIM，XC4，95％甲酰胺／1IIlMEDTA，(AlconoxPowderDetergent，乙醇)；'1 第一章：食管鳞癌的DNA甲基化特征分析仪器：Multi-SampleBeadChipAlignmentFixture，Te。Flow，Flow-ThroughChambers(withblackframes，spacers，glassbackplates，andclamps)，WashDish，WashRack，stainingrack，tuberack，真空泵，Kimwipes，iScan：一．准备工作：1．在杂交炉中取出杂交盒，不要打开，杂交盒室温冷却25分钟；2．200mlPBl加入1个WashDish(共2个)；3．150mlPBl充满BeadChipAlignmentFixture：4．准备clearplasticspacers和glassbackplates，安装好WashRack：5．取出RAl，XCl，XC2，TEM，STM，ATM解冻，3000×g离心1分钟待用；6．配置95％甲酰胺／lmMEDTA：1ml／1张芯片；7．打开Te—Flow，驱赶气泡，调节温度并且稳定在44℃；实验操作：1．WashRack放置于第一个WashDish中，并且完全被PBI浸没；2．在杂交盒中取出带有芯片的HybChamberinserts，将芯片取出inserts，掀掉IntelliHybSeal，立刻将芯片放置=t=WashRackdP；3．将带有芯片的WashRack上下提拉1分钟，注意缓慢轻柔，每次都要离开液面；4．将带有芯片的WashRack放置于第二个WashDish中，同上步上下提拉1分钟：5．装配Flow-ThroughChamber：将blackframe放置于BeadChipAlignmentFixture中，将芯片放置于blackframe(注意芯片完全被PBI浸没)，然后正确放置clearplasticspacer，再将Alignmentbar詈．=]：Fixture]：方，然后正确放置干净的glassbackplate(斜面对应,c,,片barcode，并且和芯片之间没有气泡)，再将clamps]]--确放置于两端，和上下边缘相差5毫米：6．取出Flow—ThroughChamber，剪掉多余的spacer，水平放置Flow。ThroughChamber直到进行下一步；7．Te—Flow温度稳定在44。C，将Flow—ThroughChamber正确放置于ChamberRack上，芯片barcode在上方；22 博士学位论文8．Glassbackplate的斜面中按照以下顺序依次加入(1)150St1RAl，孵育30秒，重复5次；(2)450u1XCl，孵育10分钟；(3)450ulXC2，孵育10分钟；(4)200II1TEM，孵育15分钟；(5)450Stl95％甲酰胺／1mMEDTA，孵育1分钟，重复1次；(6)再孵育5分钟；(7)Te-Flow温度调节在32"C(与STM要求温度一致)；(8)450ulXC3，孵育1分钟，重复1次；(9)等待Te—Flow温度稳定在32℃；9．打开iScan10．Glassbackplate的斜面中按照以下顺序依次加入(1)250StlSEM，孵育10分钟；(2)450ulXC3，孵育1分钟，重复1次，再孵育5分钟；(3)250ulATM，孵育10分钟；(4)450plXC3，孵育1分钟，重复1次，再孵育5分钟：(5)250ulSEM，孵育10分钟；(6)450ulXC3，孵育1分钟，重复1次，再孵育5分钟；(7)250PlATM，孵育10分钟；(8)450u1XC3，孵育1分钟，重复1次，再孵育5分钟；(9)250P1SEM，孵育10分钟；(10)450p1XC3，孵育1分钟，重复1次，再孵育5分钟；11．将Flow-ThroughChamber在ChamberRack上取出，水平放置；12．310mlPBl加入第1个washdish，将stainingrack置于其中；13．拆除Flow-ThroughChamber，取出芯片，放置于stainingrack中(注意芯片barcode背向实验员，stainingrack的lockingarm面向实验员)；14．将带有芯片的stainingrack上下提拉10次，注意缓慢轻柔，每次都要离开23 第一章：食管鳞癌的DNA甲基化特征分析液面，然后浸泡5分钟：15．剧烈振摇XC4后，310mlXC4加入第2个washdish，将stainingrack在第1个washdish中取出再置于第2个washdish；16．将带有芯片的stainingrack上下提拉10次，注意非常缓慢轻柔，每次都要离开液面，然后浸泡5分钟；17．将带有芯片的stainingrack取出后，立刻芯片正面向上水平放置于tuberack上：18．将芯片在stainingrack中取出，芯片barcode正面向上水平放置于tuberack上：19．508mmHg(0．68bar)真空泵中干燥芯片50—55分钟；20．Kimwipes将芯片背面及两侧干燥的XC4擦干净，保证芯片背面平整；21．以下步骤选择(1)继续实验，iScan扫描(2)将芯片放置于原包装中，室温条件下放置于真空泵中，72小时之内iScan扫描；22．启动软件iScan扫描芯片；(1)预先下载芯片解码文件(．dmap)；(2)预先下载芯片manifest文件(．bpm)；(3)数据扫描大约需要时间：1小时；2．4芯片质控按照芯片要求对芯片进行质控，包括：染色质控、延伸质控、芯片杂交质控、靶序列移除质控、亚硫酸氢盐转化质控、特异性质控、非多态性质控、阴性质控、修复质控。 博士学位论文2．4．1染色质控-罔6芯片染色质控曰 第一章：食管鳞癌的DNA甲基化特征分析2．42延伸质控2．4．3芯片杂交质控[图7芯¨延伸质控日图8芯片杂交质控 博士学位论支2．44靶序列移除质控245亚硫酸盐转换质控图9靶序列移除质控图lO亚硫酸盐转换赝拧 第一章：食管鳞癌的DNA甲基化特征分析2．46特异性质控臼图11特异性质控}__】 博士学位论文2．4．7非多态性质控2．48阴性质控图12非多态陛质拄圈13阴性质控 第一章：食管鳞癌的DNA甲基化特征分析2．49修复质控罔14修复质撺2．5芯片数据分析2．5．1．数据导入：lnfiniumHDMethylation450KArray经芯片扫描仪Iscan扫描后，用genomestudio软件对原始数据进行颜色校正、背景处理后，导出原始数据。数据按j!c【BRB．arraytool数据导入向导的操作步骤，将r0基化芯片的原始数据导入BRB—arraytool进行下游数据分析。2．5．2．数据分布特征分析：选扦BRB-arraytool的Graphics工具，对导入的所有甲基化数姑作图，隹成直方图和箱丝图。2．5．3．非监督聚类分析：选择BRB．arraytool的Cluster[具，对整体甲基化芯片数据进行样本『日J的非监督聚类分析，样本之间的聚类距离选择欧氏距离。2．5．4多维尺度分析：选择BRB-arraytool的多维尺度工具，对整体甲摹化芯片数据投射在三维卒问上，对样本问的空问距离进行分析。2．5．5基因集分析：选择BKB—arraytool的GeneSetComparisonTool工具，分析食管鳞癌和正常组织问预定义分类中基因集的差异表达情况。 博士学位论文3．实验结果3．1数据整体分布分析InfiniumHDmethylation450KArray实验的原始数据按照BRB—arraytool的数据导入向导要求导入BRB—arraytool，经过背景颜色校正，标准化，数据logz转换，12个样本的数据分布特征相似(见图15，16)，这说明食管鳞癌和正常组织在整体上没有差异。oT-Nn寸rNn寸r—n寸Z∞‘I)‘I’卜图1512个样本的原始数据，经log：转换，标准化处理后全部数据的箱丝图O；巴oo一．IO》篁∞CgC一口O一 第一章：食管鳞癌的DNA甲基化特征分析藤；㈣多．～_蘸{删疆k藤|】拼j=定删瓣毹；桶辩爱．!；多删誊垂li删缓捌i测重jl图16原始数据，logz转换后，标准化处理后，12个样本的全部数据直方图3．2样本间非监督聚类分析对12个样本的整体数据非监督聚类分析，分析结果(见图17)表明，样本主要分为两个聚类簇：食管鳞癌和正常组织。其中正常组织包括癌旁组织和正常食管粘膜组织。非监督聚类分析说明食管鳞癌和正常组织在DNA甲基化模式存在显著差异。癌旁组织和正常食管粘膜组织的DNA甲基化特征相似，相同组织来源样本相似性更强，相互靠的更近。 博士学位论文∞UC∞*口C口∞口t)丁山Dendrogramforclusteringexperiments，usingeuclideandistanceandcompletelinkage．PF；。j：掣葛鬲乏呈霸呈兰罔I7原始数槲】092转换，标准化处理后，全部数捌的非监督聚光分析，非监懵聚娄分析表明样本}耍分为阿类：肿瘤组织和正常组织(T：tumortissue：S：surroundingtissue：N：normaltissue：)3．3多维尺度分析多维尺度分析能够把高维数据非线性映射到_二维或i维空间米显示，使得往显示卒问rfl样本之间的距离关系能够最佳地反映样本在原高维卒间中的关系。12个样本的DNA甲基化数据多维尺度分析显示在空间距离上食管鳞癌组织样本相互稚近，癌旁组织和jF常食管粘膜组织相互靠近，并且组织Ⅱ分类之问同样的组织样本靠的更近(见图18)。这个结果与非监督聚类分析的结粜一致。 第一章：食管鳞癌的I)iVA甲基化特征分析图18原始数据I092转换，标准化处理后，全部数据的多维尺度分析3A基因集分析基因富集统计分析方法为GeneSetAnalysis，该方法使用“maxmean”做为检验统计量，该方法改良了原本Genesetenrichmentanalysis(GSEA)算法‘”用丁评估预先定义基因集显著性水甲的方法。GOONTOLGY富集分析发现在食管鳞痛和对照正常组纵之问甲基化差异的基吲集有252个，其中甲基化差异基因数日大于50个的基l纠集有51个(a-0005，见表1)。信号通路分析选择BiocartaPathway和KEGGPathway数据库．Bioearla信号通路分析发现有46个信号通路在食管鳞癌和正常对照之问存在差异．其中甲基化差异基因数目大于10的信号通路有35个(n=o05见表2)。KEGG信号通路分析发现有28信号通路在食管鳞痛和正常对照之间存在差异，其中|_1_i基化筹异基凼数目大干10的信号通路有26个(o=005见表3)。 博士学位论文G0NumberofEfron-TIhhirani’0GSAGOcategoryG0termontologygenestestp-valuepositiveregulationofGO：200】056BPcystcine-typeendopeptidaseloo<0．005(+)activityG0：∞6004tBPretinadevelopmentin99<0．005(+)camers．-typceyeGo：0030666CCendocytlcvesiclemembrane98<0．005(+)G0：O006023BPaminoglycanbiosynthetic98<0．005(+)processcardiacchamberGO：0003206BP98<0．005(+)morphogenesispositiveregulationofGo：0043280BPcystcinc-typcendopeptidase97<0．005(+)activityinvolvedinapoptoticprocess、GO：0006024BPglycosaminoglycan97<0．005卜)biosyntheticprocessGO：O009566BPfertilization94<0．005(+)GO：00l6050BPvesicleorganization93<0．005(+)G0：0043393BPregulationofproteinbinding93<0．005(+)G0：0008238MFexopeptidaseactivity93<0．005(+)G0：0007259BPJAK—STATcascade93<0．005(+)G0：000l764BPneuronmigration93<0．005(+)35 第一章：食管鳞癌的DNA甲基化特征分析RNApolymcraseIICOlepromoterproximalregionGo：0000982MFsequence-specificDNA91<0．005(”bindingtranscriptionfactoractivityGO：000323lBPcardiacvenn-icledevelopment90<0．005(+)Go：003505IBPcardiocytedifferentiation88<0．005(+)Go：0031099Bpregeneration87<0．005(+)G0：006135lBPneuralprecursorcell87<0．005(+)proliferationGo：0030216BPkeratinocytediffa'entiation86<0．005(+)G0：0034332BPadhe他nsjunctionorganization84<0．005(+)Go：0035770CCribonucleoproteingranule83<0．005(+)G0：0055072BPironionhomeostasis82<0．005(+)Go：0045766BPpositive．regulati．onof82<0．005(+)angiogcncsisG0：O004519MFendonucleaseactivity82<0．005(”GO：0007224BPsmoothenedsignalingpathway82<0．005(+)G0：0035265BPorgangrowth8l<0．005(+)36 博士学位论文Go：∞15078MFhydrogeniontransmembrane80<0．005(+)wonsporteractivityG0：0031348BPnegativeregulationofdefense79=10，000Xg的速℃下全速离心30秒。去除滤出液。9．添加100u1M—WashBuffer到柱中。全速离心30秒10．添加200u1的M-DesulphonationBuffer到柱中并在室温下(20—30℃)放置15—20分钟。孵育后，全速离心30秒。11．添加200ul的M-WashBuffer到柱中。全速离心30秒，再添加200ul的M-WashBuffer到柱中，全速离心30秒。12．将柱子放置在1．5ml的离心管中。直接添加12pl的M-ElutionBuffer到柱基质中。全速离心30秒来洗脱DNA。2．4MSP(methylationspecificPCR)反应基因启动子区甲基化状态检测方法采用甲基化特异性PCR法(methylation—SpeeifiePCR，MSP)该方法由Herman等于1996年首先提出，基本原理是运用亚硫酸氢钠(NaHS03)处理DNA样本，通过化学作用，非甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶， 博士学位论文而甲基化的胞嘧啶保持不变。根据待测DNA序列，分别设计甲基化和非甲基化两套不同的弓I物对，在后续PER反应中，若甲基化引物能够扩增出条带，则说明样品待测位点的CPG岛中胞嘧啶呈甲基化状态，若非甲基化引物能够扩增出条带，则说明样品待测位点的CpG岛中胞嘧啶是非甲基化的。阳性对照采用CpGMethyltransferase(M．Sssl)(EM0821，ThermoFisher)修饰外周血淋巴细胞DNA获得，同时设置双蒸水为阴性对照。琼脂糖凝胶电泳采用2％的浓度。壅!呈!塑壁型壁旦堡垦堕叁壁GenesPrimersequencestem遄警c)Psizro删duct1丽菇i—订1行丽西亓亓亓而丽薇菇面广——————面—————-『r3R：AACCCAAACTACTCGCCGCFUF：AGGTTGGTI，]几TrTITGTATGGT]"64114R：AACCCAAAAC．I=AClfCACCACTGPX3MF：CGTTC(}1rrTl7IbAAA=I]叽A(；TC62140R：CTACCl：AATCCCrI：久ACCACCGTUF：TGll’rGT-11．I。I’GAAArrI弘G11、GT62140——一坠型塑巡堡望丝堑曼丝垒曼g—M：甲基化．U：非甲基化；F：上游弓l物嚣下游引物2．5电泳分析取Pcr产物进行2％琼脂糖(西班牙产，购自北京鼎国生物技术有限责任公司)凝胶电泳，EB染色后在紫外透射仪(TL一2000，TranS—linker，Upland，USA)上观察结果，在凝胶成像系统(Imagemaster，PharmaliaBioteeh，USA)上摄片留存。2．6统计分析统计分析软件为SPSS20．0，数据录入SPSS20．0统计分析，统计分析方法为x2检验，d=O．05，多重检验经Bonferroni校正。用受试者工作特征曲线(ROCcurve)分析血浆中EPB41L3与GPX3甲基化对食管鳞癌的诊断价值。3．结果3．1EPB41L3、GPX3在食管鳞癌和癌旁组织中的甲基化差异及其与临床资料的关系我们通过食管鳞癌甲基化谱和表达谱的联合分析，发现了168个表达可能 第三章：BPB41L3、GPX3在肿瘤组织及血浆中的甲基化差异及其对食管鳞癌诊断价值受DNA甲基化调控的基因。我们选择EPB41L3和GPX3的启动子区甲基化在42个食管鳞癌组织和42个癌旁组织中验证。甲基化的图例见图26，在所有样本中都检测出了非甲基化。甲基化特异性PCR分析显示，在食管鳞癌组织标本中EPB41L3和GPX3的甲基化频率分别为59．5％和54．8％，统计分析发现，EPB41L3和GPX3在食管鳞癌组织中的甲基化频率明显高于癌旁组织的甲基化频率4．8％和9．5％(见表6)，差异有统计学意义。我们同时也探讨了EPB41L3，GPX3的甲基化状态与食管鳞癌患者的临床资料的关系。统计分析发现，EPB41L3的甲基化频率在肿瘤≥5cm组和病理分期的T3组的甲基化频率高于肿瘤<5cm组和病理分期T卜T2组，差异有统计学意义(x24．061，P=O．044和x2=10．456，P=O．001)(见表7、8)。病理分期的T3组，N2组和病理分期T1-T2组，NO-N1组相比，GPX3的甲基化频率较高，差异有统计学意义(X2=7．435，P=O．006和X2=11．181，P=O．001)(见表7、8)。另外，EPB41L3和GPX3的甲基化频率在性别，年龄，肿瘤家族史，肿瘤病理分化程度，吸烟，饮酒之间没有统计学差异(P