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学校代码：10564学号：2016307444分类号：S855.3密级：硕士学位论文PEDV分子流行病学调查及其调控细胞因子的研究王艳午第一指导教师：宋长绪研究员第二指导教师：张胜勋高级兽医师学院名称：动物科学学院专业学位类别：农业硕士领域：养殖答辩委员会主席：刘德武中国·广州2018年6月I II 摘要猪流行性腹泻（Porcineepidemicdiarrhea，PED）是由猪流行性腹泻病毒（Porcineepidemicdiarrheavirus，PEDV）感染猪引起的严重接触性传染疾病，其临床症状主要表现为感染猪群食欲不振，哺乳仔猪呕吐，水样腹泻，脱水死亡。近年来，PEDV发病率逐年增高，给养殖业带来了巨大的经济损失。为了解中国内地的PEDV流行情况，筛选合适的PEDV疫苗，本研究对2016~2017年采集的来自国内疑似腹泻样品共37份，利用RT-PCR对37份疑似样品进行PEDV抗原检测，其中32份为PEDV阳性病料。通过RT-PCR方法扩增毒株的S基因片段序列、M基因序列及ORF3基因序列，并与国内外GenBank发布的PEDV毒株序列做比较，对中国内地PEDV流行毒株进行遗传进化分析，比较核苷酸和氨基酸序列同源性及氨基酸序列变异情况。S基因片段遗传进化分析表明，本研究检测的32株PEDV毒株中有26株与变异毒株CH/JXJA/2017和AJ1102处于同一分支；S基因核苷酸序列同源性分析表明，本研究所测毒株之间的核苷酸序列同源性为85.9%～100%，与韩国毒株VirulentDR13、越南毒株VAP1113-1、美国毒株OH851和欧洲毒株CV777等参考毒株的核苷酸序列同源性为85.2%～98.1%；对S基因片段编码的氨基酸序列同源性分析表明，本研究所测毒株之间的氨基酸序列同源性为81.1%～100%，与参考毒株的同源性为79.2%～97.2%；本研究所测毒株的S基因编码的氨基酸序列有部分氨基酸位点的插入和缺失，且氨基酸位点的突变较多。M基因的遗传进化分析表明，本研究所测毒株之间的核苷酸序列同源性为97.1%～100%；与韩国毒株VirulentDR13、越南毒株VAP1113-1、美国毒株OH851和欧洲毒株CV777等参考毒株的同源性为96.0%～100%；对M蛋白氨基酸序列同源性分析比较，本研究所测毒株之间的氨基酸序列同源性为96.5～100%，与参考毒株的同源性为95.2%～97.2%；M基因编码膜结构蛋白，氨基酸序列较为保守，少数毒株在其中4个氨基酸位点发生突变，部分毒株氨基酸位点存在缺失。对所检测到的32株PEDV毒株的ORF3基因进行遗传进化分析发现，所测毒株之间的核苷酸序列同源性为89.3%～100%，与参考毒株的同源性为59.7%～100%；本研究所测毒株之间的氨基酸序列同源性为89.8%～100%，与参考毒株氨基酸的同源性为59.6%～100%，6处氨基酸位点存在明显突变，其它少数位点存在少量氨基酸突变。近年来PEDV给养殖业带来了巨大的经济损失，PEDV感染机体的致病机制一III 直是困扰人们的问题，本研究初步探讨了PEDV感染细胞调控细胞因子的机制，结果表明PEDV感染细胞后能够上调Vero细胞中趋化因子CCL2、CXCL10和IL8以及促炎因子IL6和肿瘤坏死因子TNFα的表达量；研究显示PEDV的nsp4蛋白通过激活NK-κΒ信号通路，进而引起这些细胞因子表达量的上调。通过siRNA干扰试验下调Vero细胞中CCL2、CXCL10、IL8、IL6和TNFα的表达量，利用荧光定量PCR方法检测细胞中的PEDV病毒载量，结果显示下调细胞因子CCL2、CXCL10、IL8、IL6和TNFα的表达量有利于PEDV复制。通过在VeroE6细胞中过表达CCL2、CXCL10、IL8、IL6和TNFα，利用荧光定量PCR方法测定细胞中PEDV病毒载量，结果显示CCL2、CXCL10、IL8、IL6和TNFα的过表达抑制PEDV的复制。本研究表明中国内地PEDV流行毒株以变异毒株为主，且大部分毒株的S基因存在较多核苷酸位点的插入和缺失，少量毒株的ORF3基因存在核苷酸位点缺失，M基因较为保守。PCMV-PEDV-nsp4通过激活NF-κΒ信号通路促进Vero细胞中趋化因子CCL2、CXCL10和IL8以及促炎因子IL6和肿瘤坏死因子TNFα的表达量的上调，抑制病毒复制，这些结论为PEDV防控和阐明PEDV致病机制提供了理论基础。关键词：猪流行性腹泻病毒；遗传进化分析；细胞因子；信号通路IV MolecularlyepidemiologicalinvestigationofporcineepidemicdiarrheavirusinchinaandStudyoncytokineregulationmechanismofPEDVWangYanwu(CollegeofAnimalScience,SouthChinaAgriculturalUniversity,Guangzhou510642，China)Abstract:Porcineepidemicdiarrhea(PED)isahighlycontagiousinfectiousdiseaseofswine,causedbytheporcineepidemicdiarrheavirus(PEDV).Thisdiseaseischaracterizedbyinappetence,acuteenteritis,suckingpigletsvomiting,waterydiarrheaanddehydrationofdeath.Inrecentyears,theincidenceofPEDVhasincreasedyearbyyear,bringinghugeeconomiclossestothepigindustry.Inthisstudy,atotalof37samplesofsuspecteddiarrhea,inChinafrom2016to2017,weretestedforPEDVantigenbyRT-PCR,and32PEDV-positivesampleswereidentificited.TheSgenefragmentsequence,Mgenesequence,andORF3genesequenceoftheidentificationofstrainswereamplifiedbyRT-PCRandcomparedwiththePEDVstrainsequencespublishedinGenBankathomeandabroad,comparingnucleotideandaminoacidsequencehomologyandaminoacidsequencechangestomakegeneticevolutionanalysisoftheepidemicstrainPEDVinChina.Thegeneticevolutionanalysisofthe32PEDV-positiveidentificationofstrainsshowedthatthehomologyofthe32PEDV-positiveidentificationofstrainswas89.3%-100%,andthehomologywiththereferencestrainwas59.7%-100%;Theaminoacidhomologyofthe32PEDV-positiveidentificationofstrainswas89.8%to100%,andwiththereferencestrainswas59.6%to100%.ThegeneticevolutionanalysisoftheSgenefragmentrevealedthat26ofthe32PEDV-positiveidentificationofstrainsthisstudywerekindofHighlypathogenicvariantstrains,highlyhomologoustotheCH/JXJA/2017strainandAJ1102.TheaminoacidhomologyanalysisshowedthatthehomologyoftheSgeneofthe32PEDV-positiveidentificationofstrainswas85.9%-100%;thehomologybetweenthe32PEDV-positiveidentificationofstrainsandthereferencestrains,liketheKoreanstrainVirulentDR13,theVietnamstrainVAP1113-1,theUSstrainOH851,theEuropeanstrainCV777,etc.was85.2%～98.1%.Comparingtheiraminoacidhomology,thehomologyofthe32PEDV-positiveidentificationofstrainswasbetween81.1and100%,andthehomologywiththereferencestrainswasbetween79.2%and97.2%.AnalysisoftheproteinsequenceencodedbytheSV genefragmentrevealedthatsomeoftthe32PEDV-positiveidentificationofstrainshadinsertionsanddeletionsofaminoacid,andthereweremoremutationsintheaminoacidsites.ThisalsoindicatedthattheSgenefragmenthasahigherchanceofgeneticvariation.ThegeneticevolutionanalysisoftheMgenerevealedthatthenucleotidehomologiesofthe32PEDV-positiveidentificationofstrainsrangedfrom97.1%to100%,andthehomologybetweenthe32PEDV-positiveidentificationofstrainsandthereferencestrains,liketheKoreanstrainVirulentDR13,theVietnamstrainVAP1113-1,theUSstrainOH851,theEuropeanstrainCV777,etc.wasbetween96.0%and100%.Comparingtheiraminoacidhomology,thehomologyofthe32PEDV-positiveidentificationofstrainswasbetween96.5and100%,andthehomologywiththereferencestrainswasbetween95.2%and97.2%.SincetheMgeneencodesamembranestructuralprotein,whichisrelativelyconserved,theanalysisoftheencodedaminoacidsequencerevealedthatafewisolatedstrainsweremutatedat4aminoacidsites.AnalysisoftheaminoacidsequenceencodedbytheORF3geneofthe32PEDV-positiveidentificationofstrainsrevealedthatsomeoftheaminoacidsequencesofthestrainsweredeleted,ThereisacloserelationshipbetweenORF3proteinandPEDVvirulence,whosechangeofaminoacidsequencewillleadtothechangeofPEDVvirulence,6aminoacidsitesweresignificantlymutated,andsomeotherregionswerefoundafewaminoacidmutations.Inrecentyears,theepidemicofPEDVhasbroughthugeeconomiclossestopigindustry.ThepathogenicmechanismofPEDVhasalwaysbeenaproblemthathasplaguedpeople.Inthisstudy,cytokineregulationmechanismofcellinfectiedbyPEDVwasbeenstudied.TheresultsshowedthatPEDVcouldup-regulatechemokineCCL2,CXCL10andIL8,andproinflammatoryfactorIL6andTNFα.Furthermore,PEDVnsp4couldup-regulatethesecytokinsthroughactivatingNK-κBsignallingpathway,Next,thetranscriptionofthesecytokinesweredown-regulatedbysiRNAinterferenceassayandtheviralloadofPEDVweredetectedbyreal-timePCR,theresultsshowedthatPEDVreplicationwasincreased.Then,thesecytokinswereoverexpressedandtheviralloadofPEDVweredetectedbyreal-timePCR,theresultsshowedthatPEDVreplicationwasinhibited,itwasfurtherconfirmedthattheup-regulatedcytokineshadaninhibitoryeffectonviralreplication,therebyrevealinganumberofchangesinthePEDV-infectedorganism.ThestudyindicatedthattheepidemicstrainofPEDVwasmainlycausedbymutantstrainsinChina,andmostoftheSgeneswerewidelyinsertedandlacking.AsmallnumberofORF3geneswerelacking,andMgeneswererelativelyconservative.PVMV-PEDV-VI nsp4byactivatingtheNF-kappaΒsignalpathwaytopromotetheexpressionofchemokineCCL2,CXCL10andIL8,andproinflammatoryfactorIL6andTNFα,inhibitingviralreplication.TheseconclusionsprovideatheoreticalbasisforthepreventionandcontrolofPEDVtransmission.Keywords:Porcineepidemicdiarrheavirus;geneticevolutionanalysis;cytokines;SignalingpathwayVII 缩略语及英汉对照英文缩写英文对照中文对照aaAminoacid氨基酸AmpAmplicillin氨苄青霉素cDNAComplementaryDNA与RNA互补的DNADMEMDulbecco＇ModifiedEagleMedium一种细胞培养基IKKIkappaBkinaseIκΒ激酶IKKiinducibleIκΒkinase诱导κΒ激酶E.coliEscherichiacoli大肠杆菌ILinterleukin白细胞介素ddH2ODoubledistilledH2O双蒸水DNADeoxyribonucleicacid脱氧核糖核酸dNTPDeoxyrinediaminetriphosphate脱氧核糖核苷三磷酸EBEthidiumbromide溴化乙锭EDTAEthidiumbromide乙二胺四乙酸LPSLipopolysaccharide脂多糖NK-κβnuclearfactor-kappaΒ核因子κΒNspNonstructuralprotein非结构蛋白TNFTumornecrosisfactor肿瘤坏死因子uUnit单位Poly(I:C)Polyinosinic-polycytidylicacidsodium聚肌苷酸-聚肌酐酸293T293cell人胚胎肾细胞系VeroAfricanGreenMonkeyKidneycell洲绿猴肾细胞VeroE6AfricanGreenMonkeyKidneycellline绿猴肾细胞株LBLuria-BertanimediumLB培养基nm,mmNanometer,Millimeter纳米，毫米ntNucleticacid核苷酸ODOpticaldensity光密度VIII ORFOpenreadingframe开放阅读框CPECytopathiceffect细胞病变PBSPhosphatebufferdsaline磷酸盐缓冲液PCRPolymerasechainreaction聚合酶链式反应PEDPorcineepidemicdiarrhea猪流行性腹泻PEDVPorcineepidemicdiarrheavirus猪流行性腹泻病毒RERestrictionendonuclease限制性内切酶r/minRotationperminute每分钟转速IgImmunoglobulin免疫球蛋白RNARibonucleicacid核糖核酸RT-PCRReversetranscriptpolymerasechainreaction反转录聚合酶链反应sec,min,h,dSecond,Minute,Hour,Day秒，分，小时，天TEMEDTetremethyethylenedamine四甲基乙二胺TCID5050percenttissuecultureinfectivedose组织培养半数感染量TGETransmissiblegastroenteritis猪传染性胃肠炎TGEVTransmissiblegastroenteritiscoronavirus猪传染性胃肠炎病毒UTRUntranslatedRegions非翻译区μg,mg,g,kgMicrogram,Milligram,Gram,Kilogram微克，毫克，克，千克μL,mL,LMicroliter,Milliliter,Liter微升，毫升，升IX 目录第一章文献综述...................................................................................................................11.1PEDV研究进展...............................................................................................................11.1.1猪流行性腹泻概述.......................................................................................................11.1.2PEDV的形态结构和理化特性....................................................................................11.1.3PEDV分子生物学特点................................................................................................21.1.4PEDV的流行病学........................................................................................................41.1.5PEDV感染猪的临床症状............................................................................................41.1.6PEDV的致病机理........................................................................................................41.1.7PEDV引起的病理变化................................................................................................51.1.8PEDV的实验室诊断....................................................................................................51.1.9PEDV的预防与控制....................................................................................................51.2细胞因子概述..................................................................................................................51.2.1不同细胞种类产生的细胞因子的分类.......................................................................61.2.2细胞因子的产生、生物学活性和主要功能分类.......................................................61.2.3细胞因子的作用特点.................................................................................................111.3核转录因子NK-κΒ......................................................................................................111.3.1真核转录因子NF-κB结构和组成............................................................................111.3.2真核转录因子NF-κB信号通路途径........................................................................121.4研究目的及意义...........................................................................................................12第二章中国南方地区PEDV流行病学调查.....................................................................132.1材料和方法....................................................................................................................132.1.1材料.............................................................................................................................132.1.2方法.............................................................................................................................152.2结果...............................................................................................................................162.2.1PEDV检测结果..........................................................................................................162.2.2PEDVS基因片段，M基因，ORF3基因扩增结果................................................172.2.3PEDV基因参考序列..................................................................................................182.2.4S基因的遗传进化分析..............................................................................................19X 2.2.5S基因片段核苷酸序列及编码的氨基酸序列同源性分析......................................202.2.6S基因片段编码的氨基酸序列分析..........................................................................202.2.7M基因遗传进化分析.................................................................................................232.2.8M基因核苷酸序列及编码的氨基酸序列分析.........................................................242.2.9ORF3基因遗传进化分析..........................................................................................262.2.10ORF3基因核苷酸序列及编码氨基酸同源性和氨基酸序列分析........................272.3讨论................................................................................................................................28第三章PEDV调控细胞因子机制的研究..........................................................................313.1材料和方法....................................................................................................................313.1.1材料.............................................................................................................................313.1.2方法.............................................................................................................................333.2结果................................................................................................................................443.2.1PEDV感染Vero细胞后细胞因子的表达情况........................................................443.2.2PED病毒蛋白作用NF-κΒ的研究............................................................................453.2.3PEDV-nsp4病毒蛋白通过NF-κΒ信号通路作用于细胞因子的研究....................463.2.4药物抑制NF-κΒ蛋白后细胞因子的表达情况........................................................483.2.5过表达细胞因子对病毒复制影响的研究.................................................................503.2.6IL6、IL8、TNFα、CXCL10、和CCL2表达量下调对PEDV复制的影响........523.3讨论................................................................................................................................56全文总结..............................................................................................................................56致谢..................................................................................................................................58参考文献...........................................................................................附录......................................................................................................................................66XI 第一章文献综述1.1PEDV研究进展1.1.1猪流行性腹泻概述猪流行性腹泻（Porcineepidemicdiarrhea，PED），是由猪流行性腹泻病毒（Porcineepidemicdiarrheavirus，PEDV）感染猪引起的烈性传染疾病。任何阶段的猪群都易感染PEDV，仔猪感染PEDV临床表现为粪便颜色各异、味道刺鼻、脱水严重、四肢无力、消瘦、死亡率几乎达到100%（Myersetal.,2015），中大猪表现为精神沉郁、水样粪便（Watson,2016）。1971年英格兰发生中大猪急性腹泻，临床症状与猪传染性胃肠炎病毒（Transmissiblegastroenteritiscoronavirus，TGEV）感染的临床症状极为相似，经检测排除该病由TGEV和其它已知肠道病原引起，随后该病流行到其他欧洲国家，称为“流行性病毒性腹泻”（Epidemicviraldiarrhea，EVD）(Oldhametal.,1972)。1.1.2PEDV的形态结构和理化特性1.1.2.1PEDV的形态结构PEDV属于尼多病毒目（Nidovirales），冠状病毒科（Coronaviridae），冠状病毒属（Coronavirus）的成员（Carstensetal.,2014），病毒粒子与其他冠状病毒形态基本相似，通过粪便检测病毒粒子呈现趋于球形的不同形状，包括纤突在内的病毒粒子平均直径约为130nm，范围趋于95～190nm，棒状纤突长18～23nm，呈放射状从核心向四周分布，大多数病毒颗粒有一个电子不透明的区域，图1.1为PEDV粒子在电子显微镜下图片（殷震等，1997）。图1.1PEDV电子显微镜下照片1 1.1.2.2PEDV的理化特性PEDV在实验室条件下培养非常困难，人们经过大量的试验摸索发现PEDV在Vero细胞（非洲绿猴肾细胞）能够引起细胞病变且能够持续增殖。PEDV对氯仿和乙醚等有机消毒剂敏感，在蔗糖中的浮密度为1.18g/mL，接种Vero细胞分离出的PEDV在60℃以上（含60℃）处理30min不再具有感染力，但其在50℃的条件下比较稳定，该病毒没有血凝活性。1.1.3PEDV分子生物学特点1.1.3.1PEDV的基因组结构特征PEDV为单股正链RNA病毒，有囊膜结构，整个基因组大小约为28nt（Kocherhansetal.,2001），5＇端有一个帽子结构（cap）和3＇端有Poly(A)尾结构。PEDV基因组包括6个开放性阅读框（OpenReadingFrame，ORF），从5´～3´端分别编码复制酶多聚蛋白1ab(pp1ab)、纤突糖蛋白（S）、ORF3蛋白、小膜蛋白（E）、膜糖蛋白（M）、核衣壳蛋白（N），PEDV基因组结构如图1.2所示。图1.2PEDV基因组结构PEDV各结构蛋白示意图如下1.3所示（孙振，2014）。图1.3PEDV病毒粒子形态S:纤突蛋白；M：膜蛋白；N：核衣壳蛋白；E：小膜蛋白2 1.1.3.2S基因和S蛋白PEDVS基因大小为4158~4161bp（李建强,2007），其编码的纤突蛋白与病毒吸附、侵入细胞相关，由1383个氨基酸（aa）组成，包括一个胞质区，一个跨膜区，7个中和表位（499-638，636-789，744-759，756-771，748-755，764-771及1368-1374aa）（Fengetal.,2008），一个信号肽（1-18aa）（曹丽艳，2015）。S蛋白被划分为两个区域，S1区（1-789aa）和S2区（790-1383aa）（Binnsetal.,1985），S1区变异较大，而S2较保守。PEDV感染细胞的过程中S蛋白起重要的作用，病毒通过S1亚单位上的受体区域与被感染细胞膜上的受体区域特异性结合，致使S蛋白的空间构象发生变化，从而使跨膜有效的结构域暴露出来，介导病毒包膜和细胞膜发生融合，病毒核蛋白进入细胞细胞质。S蛋白的免疫原性主要在第一条多肽链的37%序列（曹丽艳，2015），主要功能在其蛋白的前50%。S1区域构成S蛋白的球状部分，携带B细胞的主要抗原决定簇，主要中和表位存在于该区域（Leblanc,1994），是唯一能够诱导机体产生中和抗体的结构蛋白。PEDV在Vero细胞上盲传100代以后，S基因的核苷酸序列会发生改变，从而导致氨基酸序列发生变化，这也是目前PEDV毒力致弱的一个途径。由于PEDVS蛋白与PEDV毒力强度有很大的关系，且能诱导细胞免疫和体液免疫，所以常用来作为PEDV疫苗的靶蛋白（Sunetal.,2008）。临床上经常对PEDVS基因进行遗传进化分析，以区分经典毒株和野毒株，由于S基因含有抗原表位且容易变异，所以疫苗选择非常重要，养猪生产中常选用和本场毒株同源性相近的疫苗毒株进行免疫，以确保减少PEDV感染带来的经济损失。1.1.3.3M基因和M蛋白M基因大小为681bp（Jinghuietal.,2005），M蛋白是PEDV病毒囊膜结构的主要组成部分（Bing-Xiaetal.,2015），是跨膜糖基化蛋白。M蛋白短的N端存在于病毒粒子外侧，长的C端存在于病毒内部。M蛋白对病毒粒子的组装和病毒粒子成熟后的释放都具有重要的作用（Vennemaetal.,1991），感染机体后可诱导产生IFN-α（Hetal.,1992；蒋伯诚，1986），不同毒株的PEDVM基因都比较保守（Jinghuietal.,2005），实验室常用RT-PCR扩增M基因序列的方法检测PEDV的存在（Chenetal.,2008）。研究人员利用M蛋白制备单克隆抗体，其单克隆抗体能够中和PEDV病毒粒子，这也为PEDV基因工程疫苗的开发提供了理论依据（Lanetal.,3 2005）。1.1.3.4ORF3基因和ORF3蛋白ORF3基因大小为675bp，是PEDV的唯一附属基因（Fengetal.,2016），分子质量大小为25kDa，其编码的非结构蛋白具有多种功能（Wangetal.,2012）。运用生物学软对ORF3基因进行分析（Yeetal.,2015；Sunetal.,2014），发现其有三个核苷酸缺失的可变区，而这三个可变区的不同造成不同PEDV毒株毒力的强弱不同（Haijemaetal.,2004），这为区分不同PEDV毒株毒力强弱提供了理论根据（Parketal.,2008）。1.1.4PEDV的流行病学至英格兰首次爆发PED后，欧洲多个国家（Ducatelleetal.,1982；Coussementetal.,1982）和亚洲一些地区（Řeháketal.,1991）检测到PEDV抗体的存在，之后许多国家爆发PED。以往冬春是PED常发季节，现在不分季节，但冬季仍是PED易发季节，飞鸟是PEDV的病毒携带者，PEDV可经飞鸟的粪便传入猪场。粪-口传播途径是PEDV传播的主要途径，带病猪只与健康猪只接触，猪场员工的鞋底交叉污染，车辆交叉使用，都能引起PEDV的传播流行。规模猪场大多采用石灰乳（Ca(OH)2和NaOH的混合物）消毒围墙和过道，猪栏周围拉网线等措施切断传播途径。成年猪只感染PEDV不会引起死亡，产房仔小猪和保育猪感染PEDV死亡率较高。1.1.5PEDV感染猪的临床症状成年种猪感染PEDV表现为食欲不振，精神萎靡，感染猪只粪便呈浆糊状且具有腥臭味，后期为水样粪便。产房仔猪感染PEDV损失较大，0~3天的哺乳仔猪感染PEDV后迅速消瘦，呕吐、拉黄色或者青色浆糊状腥臭味粪便、脱水、死亡率可达到100%；4～7日龄的哺乳仔猪死亡率在50%以上；10日龄以上的哺乳仔猪感染PEDV后经人工辅助措施和临床治疗死亡率可控制在50%以下；中大猪感染PEDV临床表现为采食量低下，但在感染2周左右可自行恢复。1.1.6PEDV的致病机理PEDV致病机制和TGEV相似，在呼吸道及肺部器官不会复制增殖，感染作用主要是吸附在小肠上皮细胞的受体上，小肠绒毛上皮细胞感染PEDV后可散毒而不被破坏，随着上皮细胞大量脱落开始出现腹泻症状。动物感染PEDV后，引起机体发生一系列的免疫反应，是机体抵抗外部病毒入侵的自然反应，上调某些促进免疫4 反应的细胞因子的表达量以干扰病毒的复制。目前很多学者试图从PEDV感染机体后引起细胞因子的变化着手研究PEDV的致病机理，随着研究的逐步深入，一些机理的变化情况正在被人们所熟知，这也为防控PEDV带来新的理论依据。1.1.7PEDV引起的病理变化感染PEDV猪只剖检经肉眼下观察，病变主要局限于小肠，肠系膜变薄，黄色液体充满小肠且膨胀发酵。电子显微镜下观察可见小肠绒毛上部形成空泡和脱落，肠道微生物活性明显下降，小肠绒毛萎缩严重。与TGEV相比，PEDV在小猪肠道内增殖和感染的过程较慢，潜伏期相对较长。1.1.8PEDV的实验室诊断在养殖生产中PEDV、TGEV、δ冠状病毒和轮状病毒等均可以引起猪只的大规模腹泻，且存在混合感染现象。轮状病毒、δ冠状病毒和TGEV这三种重要的病原引发的腹泻情况与PEDV感染猪只出现的临床症状、病理变化特征非常相似，为确诊病毒引起的腹泻缘由，需借助实验室诊断手段进行确诊。常规的实验室检测方法有：病毒的培养与分离鉴定、中和抗体实验、免疫电镜法、间接免疫荧光、荧光定量PCR、RT-PCR（反转录聚合酶联式扩增反应）、酶联免疫吸附测定法、免疫组化等。1.1.9PEDV的预防与控制做好生物安全，全进全出，合理安排消毒防疫工作；加强饲养管理，提供营养均衡的饲料，避免产房母猪无乳症的产生，保持产房干燥，做好保温措施，尤其是产房小猪的保温；根据猪场实际情况制定科学的免疫程序，发生腹泻，可用白头翁散，平衡液，干扰素，紧急疫苗免疫等措施进行补救，无害化处理病死猪、堆肥发酵等方法。1.2细胞因子概述细胞因子（cytokine）是指免疫细胞分泌的、具有调控细胞功能、参与炎症反应和调节细胞生长分化等一类小分子多肽的总称。20世纪80年代至今，随着基因工程和细胞工程等分子生物学技术的高速发展，许多新的细胞因子被发现后，人们对其来源，分子结构和基因序列、信号转导和生物学功能进行了大量的研究。目前细胞因子在基础免疫学和临床免疫学研究中是非常热门的领域。细胞因子活性很高且一种细胞因子常伴有多种生物学功能，部分学者把细胞因子称之为“激素类”类物质。5 1.2.1不同细胞种类产生的细胞因子的分类1.2.1.1淋巴因子人们从1950年后开始对淋巴因子等一类细胞因子进行命名，产生淋巴因子的细胞包括T淋巴细胞、B淋巴细胞和NK细胞等，根据产生细胞因子的细胞种类不同来区分淋巴因子，研究较多的淋巴因子有IL2、IL4、IL10、INFγ、IL16和IL17等。1.2.1.2单核因子单核因子主要由巨噬细胞和单核细胞分泌、产生，如IL1、IL6、IL8、TNFα和M-CSF等。1.2.1.3非淋巴细胞、非单核/巨噬细胞产生的细胞因子这类细胞因子由血管内皮细胞、成纤细细胞、胸腺和骨髓中的基质细胞等细胞产生，如内皮细胞源IL8、EPO、IL7、IL11、IFNβ、SCF等。1.2.2细胞因子的产生、生物学活性和主要功能分类1.2.2.1白细胞介素白细胞介素（interleukin，IL）1979年开始正式被命名，它是由免疫细胞如T淋巴细胞（Gillisetal.,1981）、单核细胞等细胞产生的，在细胞间的免疫调节、造血、以及炎症过程中起调节作用（Chenetal.,2006）。（1）IL1白细胞介素1（interleukin1，IL1）是一种单核因子。Gery等人（Geryetal.,1972）在1972年发现白细胞培养上清中有一种可溶性物质可以促进小鼠胸腺细胞对植物血凝素（PHA）的有丝分裂反应，随着研究深入的进行，后来这种可溶性物质被统一命名为IL1。IL1具有广泛的免疫调节作用（Oppenheimetal.,1986），它与细胞膜上的高亲和力的受体（郭丹等，1999）结合而发挥生物学作用。IL1发挥作用不受种属特异的影响，促进T细胞（Oppenheimetal.,1986；Gillisetal.,1981）、胸腺细胞的增殖和分化；IL1可以协同其它细胞因子刺激B细胞（Howardetal.,1983）的增殖和分化，提高NK细胞的杀伤活性，同时还具有调节神经内分泌系统和活化血管的作用（Doerfler,1988）。IL1α和IL1β的分子结构均不含信号肽，是不同基因编码的受体激动剂，但这两个白细胞介素家族成员有共同的受体IL1R，生物学功能大体相似，都具有参与免疫应答，促进发热，调节炎性反应的功能。6 （2）IL2Morgan等人发现小鼠脾细胞培养上清中有一种物质可以促进胸腺细胞生长，由于这种物质能够培养T细胞，人们称它为T细胞生长因子（Tcellgrowthfactor，），后来命名为白细胞介素2（interleukin2，IL2）（Taniyama,1995）。1983年Taniguchi等成功克隆出人的IL2的cDNA，并且在大肠杆菌中得到高水平表达。IL的生物学功能有沿系谱向上有约束性，向下无约束性的特点。IL2可增加NK细胞的杀伤功能（Suzukietal.,1983；Handaetal.,1983），促进B细胞增殖、分化和Ig分泌，活化巨噬细胞，进而增强巨噬细胞杀死肿瘤的的能力（Zhihongetal.,2008）。（3）IL4Howard等在培养T细胞时发现细胞培养液的上清中有一种物质可以促进B细胞的增殖（Howardetal.,1982），随着研究的深入，随着1986年基因cDNA克隆的成功，这种物质被命名为白细胞介素4（interleukin4,IL4）（Potteretal.,1984）。IL4是T细胞自身分泌的生长因子，对造血细胞、B细胞、单核细胞等都具有免疫调节作用且能抑制IFNα核的分泌及NK细胞对内皮细胞的粘附（曾汝良等，2014）。IL4表达量的异常经常会给机体带来多种多种疾病（赵纪维等，2015），随着人们对IL4的研究深入，IL4在疾病治疗方面可以用来治疗肿瘤等免疫缺陷病（国畅廓等，2017；于益芝等，1993）。（4）IL61980年人们发现经过干扰素的激活剂Poly(I:C)刺激成纤维细胞后产生一种抑制病毒复制的细胞因子，随着人们对这种细胞因子的深入，1985年Kishimoto等人首先从T细胞中获得了IL6cDNA的克隆（Kishimoto,1989），白细胞介素6（interleukin6,IL6）于1986年正式命名。IL-6来源于单核细胞、成纤维细胞、T细胞、B细胞等一些淋巴细胞和非淋巴细胞。在正常情况下，IL6通过自分泌和旁分泌的形式在细胞局部发挥作用，但在生物体感染疾病时，IL6可通过全身转运功能作用其远端的靶器官（沈捷等，2009）。IL6可促进细胞的增殖和分化，参与细胞周期的调控和表达（林卡莉等，2010）。（5）IL101989年Fiorention等人发现小鼠Th2细胞株分泌一种能够抑制Th1细胞株因子mRNA转录的因子，称之为细胞因子合成抑制因子（cytokinesynthesisinhibitory7 factor，CSIF），随后将其命名为白细胞介素10（interleukin10，IL10）（周春英等，2011）。IL10来源广泛，大多数细胞都可以产生IL10，IL10具有抑制巨噬细胞MHCⅡ类抗原类分子，抑制其抗原呈递的作用，进而降低T细胞增殖水平和细胞因子的产生（冯志新等，2007；周华等，2010）。1.2.2.2集落刺激因子集落刺激因子（colony-stimulatingfactor,CSF）是根据分化不同阶段的造血祖细胞和其刺激造血干细胞在半固体培养基中形成不同的细胞集落分别命名的，比如M（巨噬细胞）-SCF、GM（粒细胞、巨噬细胞）-CSF、EPO、TPO和fl3配体等。1.2.2.3干扰素干扰素（interferon，IFN）是最早发现的细胞因子，1957年Isaacs和Lindenmann发现当一种病毒感染细胞时可以产生一种特殊的物质，这种物质可以可以干扰另一种病毒的感染和复制，由此命名这种物质为干扰素（Isaacsetal.,1987）。根据干扰素产生的来源及在酸性条件（pH=2）的耐受程度不同，将IFN分为Ⅰ型干扰素和Ⅱ型干扰素。白细胞产生IFNα（Qiuetal.,2005），成纤维细胞产生IFNβ，抗原刺激的PBMC细胞产生IFNω，活化的T细胞产生IFNγ（谢雯等，2012），这几种干扰素的生物学功能基本相同，都具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节作用（刘新垣，1981）。（1）INFα、IFNβ和IFNωα干扰素（interferonα，IFNα）、β干扰素（interferonβ，IFNβ）和ω干扰素（interferonω，IFNω）有很多的相似的地方，推测他们可能来自同一个祖先基因，结合相同的受体，具有相似的生物学功能。很多种细胞均可以产生INFα、IFNβ或IFNω，它们的生物学功能基本相同，主要有抑制增殖、抗病毒感染和免疫调节作用（李成文等，1995）。（2）IFNγYounger和Salvin在1973年发现培养淋巴细胞的上清中存在一种IFN，其抗原性与之前发现的IFN不同，于是命名为Ⅱ型IFN（齐铁雄等，2006），于1980年统一命名为IFNγ（interferonγ），之后于1981年Goeddle将γ干扰素基因克隆成功（Kirchner,1984）。IFNγ主要来源于活化的NK细胞（朱仲丽等，2012）和T细胞（严俊等，1992），IFNγ与INFα/β许多生物学功能相似，但IFNγ生物学作用有较8 为严格的种属特异性（茅奇峰，2011；柳亚楠等，2015）；IFNγ具有较为广泛的免疫调节作用（王秋实等，2013），明显诱导B细胞、T细胞、巨噬细胞等细胞MHCⅡ类分子的表达（王彦彬etal.,2007），进而提高抗原呈递能力（雷虹等，1998）；IFNγ可诱导巨噬细胞可诱导性一氧化氮合酶（induciblenitricoxidesynthase，iNOS）产生，促进NO的合成（田珂，2008；李康等，2008；张颖等，2016），是INFγ杀伤胞内病原体和抗肿瘤以及抑制病毒复制的机制之一（陈奇英，2009），IFNγ也可以用来治疗弓形虫和利什曼原虫感染性疾病（窦永喜，2008）。1.2.2.4肿瘤坏死因子1975年Carswell等人发现注射LPS到接种BCG的试验小鼠后，小鼠血清中出现一种能破坏某部分肿瘤细胞或使肿瘤组织出现坏死的物质，将其命名为肿瘤坏死因子（tumornecrosisfactor，TNF）（陈为歌等，2006）。TNF可分为TNFα、TNFβ和LTβ三类，单核/巨噬细胞分泌产生TNFα，活化的T细胞产生TNFβ和LTβ。肿瘤坏死因子具有杀死肿瘤细胞（蒋伯诚，1986）、免疫调节以及参与发热和炎症的作用（董碧蓉等，1991；吕志敢等，2006），目前人们已经发现的肿瘤坏死因子有19个以上。1984年人们成功克隆出TNFα的cDNA，且在大肠杆菌中高效表达，TNFα是巨噬细胞和单核细胞等免疫细胞产生的一种单核因子（马桂林等，1991），IL10、IL4、TGFβ对TNFα的产生有明显的抑制作用（吴阳阳等，2014；吴洁等，2008）。TNFα不但具有促进细胞的增殖和分化的作用（陈磊，2010），还具有抑制和杀灭肿瘤细胞的功能（李涛等，2011；范正超，2012；李清芬等，2001），生物学功能没有明显的种属特异性。1.2.2.5转化生长因子β家族转化生长因子β家族（transforminggrowthfactor-βfamily，TGF-βfamily）各个成员由不同的细胞产生，该家族成员主要有TGF-β1，TGF-β2，TGF-β1β2和BMP等。1.2.2.6趋化性细胞因子家族趋化性细胞因子家族（chemokinefamily）包括四个亚簇：①C-X-C/α亚族，主要成员有IL8、血小板碱性蛋白、血小板因子等；②C-C/β亚族，这个亚族的成员包括巨噬细胞炎性蛋白1α（MIP1α）、MIP1β、RANTES、单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1/MCAF）、MCP-2、MCP-3、和I-309等；③C-X3-C亚族，该亚族只有一9 个成员分形素（fractalkine）；④XC亚族，该亚族包括淋巴细胞趋化因子（lymphotactin，LTN）和SCM1β两个成员。（1）CXC亚族（α-亚族IL8、CXCL10）IL-8又称中性粒细胞激活蛋白1（neutrophil–activatingprotein1，NAP-1），单核细胞、表皮细胞等多种细胞都可以产生IL8，IL8无N-糖基化位点，对巯基化合物较为敏感，对酸、碱不敏感，干扰素的调节因子（IRF）和NK-κβ的结合位点位于IL8基因的上游。CXCL10（CXCchemokineligand-10，CXCL10）又称IFN-γ诱导蛋白10（IFN-γ-inducibleprotein10，IP-10），是由Luster等人1985年从活化的U937细胞株的表达物中提取出来的（Lusteretal.,1985）。NK细胞、内皮细胞和淋巴细胞等多种细胞都可以产生CXCL10，在炎性感染的过程中如TNFα、IFNα等均能刺激CXCL10的表达（Lewisetal.,1990）。CXCL10通过其受体CXCR3发挥对B细胞、NK细胞、DC、T细胞的趋化和活化功能（Brightlingetal.,2005）。（2）CC亚族（β-亚族CCL2、CCL5）CCL2(chemokineC-Cmotif2，CCL2)又称单核细胞趋化蛋白1（monocytechemotacticprotein-1）（Montietal.,2003），是CC亚族中的一个成员，由Belemabedada等人命名（Belemabedadaetal.,2008）。平滑肌细胞、单核细胞、巨噬细胞等均可分泌CCL2，CCL2通过正反馈诱导其它炎性介质的产生于释放，是炎性反应中的启动子（Satonakaetal.,2015）。CCL2通过其受体CCR2（Haringmanetal.,2006）促进巨噬细胞、淋巴细胞的聚集和向炎性细胞的迁移（Wangetal.,2009）。CCL5是活化T细胞调节的正常T细胞表达和分泌的因子(regulateduponactivation，normalTcellexpressedandsecretedfactor，RANTES)，是β亚簇的一个成员，Kroeze等人在研究基因表达产物时发现并提取然后命名为CCL5（Rookmaakeretal.,2007；Kroezeetal.,2009）。血小板、T细胞、巨噬细胞、肿瘤细胞和内皮细胞等均可分泌产生CCL5。在炎性反应的过程中，趋化因子CCL5与其受体CCR5等结合后聚集白细胞到炎性区域，进而发挥作用（Griffithetal.,2014）。1.2.2.7其他细胞因子其他细胞因子还有表皮生长因子（EGF）、成纤维细胞生长因子（FGF）、肝细胞生长因子（H-GF）、白血病抑制因子（LIF）、神经生长因子（NGF）、抑瘤素M（OSM）、血管内皮细胞生长因子（VEGF）等。10 1.2.3细胞因子的作用特点大多数细胞因子为分子量小于25kDa的糖蛋白且以单体的形式存在，少数以二聚体、三聚体或四聚体的形式发挥生物学功能。大多数编码细胞因子的基因为4～5个外显子和3～4个内含子组成的单拷贝基因。细胞因子通常以旁分泌（paracrine）或自分泌（autocrine）形式作用于产生细胞因子的细胞本身的细胞或者以跨膜形式（TNFα）和膜结合形式（IL-8）作用附近相邻的靶细胞。在正常情况下细胞因子在短暂的时间内以高浓度起作用，高效能调节机体的免疫应答、造血功能和炎症反应等。同一种细胞因子可以由多种细胞产生，而且不同细胞因子可以有相同的功效，每个细胞因子也有多种功效，细胞因子之间也存在相互作用，细胞因子和激素、神经肽、神经递质等物质共同组成了细胞间信号通路系统。1.3核转录因子NK-κΒNF-κB(nuclearfactor-κB)是一种用途广泛的真核细胞转录因子，很多细胞外因素可以激活NF-κB。NF-κB具有参与细胞生长、分化和炎症反应等多种基因调控功能。自从1986年发现NF-κB以后，人们对NF-κB蛋白研究越来越多，研究表明NF-κB和胞浆内蛋白组成NF-κB调控系统，NF-κB的蛋白活性受这个系统的调控。在正常情况下，NF-κB蛋白与其抑制蛋白I-κB（inhibitorκB）家族成员在细胞质中结合，当细胞受到外界条件的活化刺激后，IKK（I-κΒkinase）催化I-κB自身磷酸化，NF-κB、IKK和I-κB组成了NF-κB信号通路系统。1.3.1真核转录因子NF-κB结构和组成NF-κB蛋白分子是由Rel蛋白家族成员以同源或异源二聚体的形式组成的一组转录因子。在该家族成员的N段，大约有300个氨基酸残基左右的Rel同源结构域（Rel-homologydomain,RHD）（Xiao,2004），这些区域的某些位点可以与其他Rel蛋白、DNA和IκB结合。Rel家族成员部分以同源二聚体（p50/p50、p52/p52、p65/p65）或者异源二聚体(p50/p65)存在，目前所讲的NF-κB主要是指p50/p65，因为p50/p65是发现最早，分布最广泛的NF-κB.11 图1.4NF-κB结构组成（Xiao,2004）1.3.2真核转录因子NF-κB信号通路途径在正常的细胞质中，NF-κB蛋白家族和其抑制蛋白I-κB家族成员结合稳定地存在细胞质中，当外界刺激如dsRNA、病毒蛋白及病毒粒子、紫外线（UV）白细胞介素（IL-1）等（Karinetal.,2002），这些细胞外的信号经过细胞的病原模式识别受体（PRR）进行信号传导等一系列途径最终导致NF-κB活化（Lietal.,2002），NF-κB的激活主要经过经典途径（classicalNF-κBpathway）和旁路途径（alternativeNF-κBpathway）（图1.5）图1.5NF-κB激活的经典途径和旁路途径（Wieteketal.,2007）1.4研究目的及意义PED于1971年在英格兰首次爆发，随后在法国、荷兰、保加利亚等国迅速蔓延。至2010年以来，我国多个省份先后爆发PED，造成产房仔猪的大量死亡、保育猪和12 育肥猪料肉比升高，给国内养殖企业带来巨大的经济损失。2013年4月美国报道出第一例PEDV，在此后大约1年时间PEDV传播至美国30个州的6000多家猪场，这次PED的爆发给美国养猪业带来沉重的打击，产房仔猪死亡惨重，PEDV随后蔓延到加拿大、墨西哥、哥伦比亚、秘鲁和日本。最近几年来，PEDV在国内流行，疫苗免疫已经不能很好的控制PED的爆发，这与PEDV的变异是分不开的。为了更深入的理解PEDV的流行特点和致病机理，本研究对中国内地2016~2017年发生腹泻的猪场进行PEDV检测，并对猪场流行的PEDV毒株进行测序，对检测毒株基因片段进行遗传进化分析，以便掌握该地区PEDV的流行特征；本试验对PEDV体外感染引起细胞因子表达机制进行研究，为深入理解PEDV致病机制和宿主防御机制奠定基础。第二章中国南方地区PEDV流行病学调查2.1材料和方法2.1.1材料2.1.1.1样品来源从广东、福建、海南、四川、陕西、湖南、江西、广西、贵州、甘肃、辽宁和湖北等地采集37份样品，对临床症状表现为腹泻、呕吐和脱水的猪只采集其粪便、小肠及肠道内容物，样品来源见表2.1.13 表2.1样品来源样品来源采样时间样品份数样品来源采样时间样品份数湖北2016101福建2017071广东2016112广西2017081广东2017122贵州2017091福建2017123湖南2017101海南2017012广东2017112海南2017021福建2017112江西2017032广西2017112陕西2017041甘肃2017123广东2017041四川2017122福建2017051辽宁2017123广东2017061广东20171222.1.1.2主要试剂盒Magen病毒总核酸快速抽提试剂盒（PapureViralRNA/DNAKit）购自Magen广州欣妍生物公司。2.1.1.3引物利用Oligo6.0生物学分析软件，根据NCBI/GenBank发布的PEDV序列设计PEDVS基因片段、M基因和ORF3基因的3对特异性扩增引物，见表2.2.表2.2检测引物引物名称引物序列5＇-3＇扩增长度ORF3-FCGGTGCTTGTTTTTCAGGTTG835bpORF3-RCAATTGGACGAAGGTAATGCTM-FGTCTTACATGCGAATTGACC817bpM-RGGCATAGAGAGATAATGGCAS-FGGTAAGTTGCTAGTGCGTA1698bpS-RCACAGAAAGAACTAAACCC14 2.1.1.4磷酸盐缓存溶液PBS溶液的配制：NaCL8g，KCL0.2g，Na2HPO412H2O3.58g，kH2PO40.27g，定容到1L水。2.1.1.5其他主要试剂诺唯赞HiScriptⅡOneStep、EB核酸染料购自北京华奇公司。2.1.1.650×TAE电泳池缓冲液称取242gTris，EDTANa22H2O37.2g置于1L烧杯中，向烧杯中加入约800mL双蒸水，充分搅拌均匀，加入57.1mL的冰乙酸，充分溶解，用NaOH调pH至8.3，加去离子水定容至1L后，室温保存。2.1.1.7琼脂糖凝胶（1.0%）称取琼脂糖粉0.25g，将所称量的琼脂粉加入25mLTBE缓冲液，在锥形瓶中混合，微波炉高温加热1min至琼脂粉充分溶解，在洁净的胶槽内放好梳子，待胶温度在55℃左右时往胶内滴加2.5μLEB核酸染料，轻微震荡混匀，冷却至胶即将凝固时缓慢倒入胶板内，胶凝固后轻轻用力拔掉梳子。2.1.1.8主要仪器设备水平电泳系统：北京六一仪器厂SW-CJ-1FD型洁净工作台：苏州安泰空气技术有限公司常温离心机：上海安亭科学仪器厂低温冷冻冰箱：日本SANYO公司PCR扩增仪：美国AppliedBiosystems公司低温高速离心机：BECKMANAvantiTM型HVE-50型高压灭菌锅：日本Hirayama公司UP50超纯水仪：德国密理博公司2.1.2方法2.1.2.1病料的采集取新鲜病料置于PBS中，加入无菌的粉碎机，低温匀浆处理后转移至2mLEP管中，粪便用PBS稀释震荡混匀，处理后的病料样品反复冻融3次，12000r/min离心3min，取分离的上清液体-80℃冰箱冷冻保存。15 2.1.2.2总RNA提取Magen试剂盒提取总RNA步骤：转移20μLproteinaseK至1.5mL的EP管中；转移处理混匀后的病料样品上清200μL至装有proteinaseK的1.5mL的离心管中，轻柔混匀震荡7秒；加入500μLBufferⅠ至样品中，涡旋混匀20秒，室温静置10分钟；把HipureRNAColumnA装在2mL收集管中，转移混合液至柱子中，12000r/min离心1分钟；弃废液回收柱子放收集管中，加入500μLBufferⅡ至柱子中12000r/min离心1分钟；倒弃废液回收柱子重新放进收集管中，加入650μLBufferⅢ至柱子中12000r/min离心1分钟；弃废液回收柱子放收集管，12000r/min离心3分钟以甩干柱子；转移柱子至新的1.5mL收集管，加入30μLddH2O至柱子的膜中央，12000r/min离心1分钟，弃去柱子，收集RNA保存于-80℃。2.1.2.3RT-PCR利用诺唯赞一步法体系扩增，扩增体系见表2.3。表2.3RT-PCR扩增体系体系扩增体系体积2×OneStepMix12.5μLRNasefreeddH2O7.5μLOneStepEnzymeMix1μLPrimerF1μLPrimerR1μLRNA2μLTotal25μL将配好的PCR反应体系涡旋震荡混匀后，按如下反应程序扩增：50℃反转录30min，94℃预变性3min，94℃变性30sec，56s退火30sec，72℃延伸2min，34个循环后，72℃环终延伸10min。2.2结果2.2.1PEDV检测结果从采集37份样品中检测出PEDV阳性样品32份，阳性率为86.49%，测序所得PEDV毒株序列详情见表2.4。16 表2.4本实验检测PEDV阳性样品毒株编号毒株编号采样地点毒株编号采样地点Hb湖北襄樊Fj福建福州Qingyuan广东清远Gx广西玉林sanshui广东佛山Gz贵州贵阳Shaoguan-zhouti广东韶关Hen湖南衡阳Fujianlongyan福建龙岩Maoming广东茂名Guangdongyangjiang广东阳江Qingyuanwf广东清远Hainan-han海南文昌Fujianfuzhou福建福州Hainan-wen海南文昌Fujian福建福州Jiangxiwf江西赣州GXn广西南宁Shanxidingyuan陕西定远Shantou广东汕头Fujiand福建福清Shichuan四川绵阳SG广东韶关Maomingd广东茂名ZQ-D-L广东肇庆YD广东英德Maominggaozhou广东茂名S-H广东四会Shaoguanfeng广东韶关Shaoguanfanling广东茂名Heyuanwuchuan广东河源ZQ广东肇庆2.2.2PEDVS基因片段，M基因，ORF3基因扩增结果abc图2.1PEDVS基因片段（a）、M基因(b)、ORF3基因(c)扩增图图注：M:DL2000，1-5：PED阳性样品扩增图，6：阴性对照17 2.2.3PEDV基因参考序列参照国内、国外发表在GenBank上的23株PEDV代表性毒株的基因序列，下载其S基因、M基因、ORF3基因的序列，本实验研究中所用到的参考毒株序列如下：表2.5参考毒株序列信息毒株名称登录号来源时间Cv777AF353511比利时2001Chinju99AF237764韩国2002attenuatedDR13JQ023162韩国2003VirulentDR13JQ023161韩国1999SM98Gu937797韩国2002KNU-1406-1KM403115韩国2014UsCollorado30.2013KJ645638美国2013TCIowa106(pv39)-P1KM392232美国2013OH851KJ399978美国2014ISU13-19338E-IN-passage3KF650371美国2014ISU13-22038-IA-passage3KF650374美国2013NPL-PEDV/2013/P10KJ778616美国20141842/2016ITAKY111278意大利2016VAP1113-1KJ960179越南2013JS2008KC109141华东2010SD-MJX560761山东2012AH2012KC210145江苏2012Chinavaccine2013KC189944湖北2013CH/SJN547728黑龙江2011LZCEF185992甘肃2007AJ1102JX188454湖北2012CH/JXJA/2017MF375374江西201785-7-mutant2KX839248江苏201718 2.2.4S基因的遗传进化分析将扩增到S基因片段PCR阳性产物送广东天一辉远公司测序，测序结果显示PCR产物为PEDVS基因序列，运用Mega6.0生物软件对所测得的32株毒株序列与国内外具有代表性的23株毒株序列进行遗传进化分析，构建遗传进化树如图2.4所示：本研究测得32个毒株位于G1和G2分支的不同的亚型中。其中本研究所测得的毒株Hb和韩国毒株attenuatedDR13亲缘性较近，所测得的毒株Gxn与美国毒株OH851等亲缘性较近，毒株S-H和毒株Gz则处在G1亚群中一个分支，G2分支中的毒株Qingyuan和Shaoguanfanling与越南毒株VAP1113-1亲缘关系较近；而本研究所测得的其它17株毒株和2017年中国境内流行的江西毒株CH/JXJA/2017亲缘性较近，都位于G2-2-2分支。图2.2S基因遗传进化分析图注：◆标注的为本实验所测毒株19 2.2.5S基因片段核苷酸序列及编码的氨基酸序列同源性分析用DNAStar软件对所测得PEDV毒株的S基因片段进行核苷酸序列同源性分析，本研究所测得的32个PEDV毒株的S基因片段之间的核苷酸序列同源性为85.9%～100%，与韩国毒株VirulentDR13、越南毒株VAP1113-1、美国毒株OH851、欧洲毒株CV777等参考毒株的同源性为85.2%～98.1%。对S基因片段编码的氨基酸序列同源性分析比较分析，本研究所测得的PEDV毒株之间的氨基酸序列同源性为81.1～100%，与国内外其他参考毒株的同源性为79.2%～97.2%（图2.3）。图2.3S基因片段氨基酸同源性分析2.2.6S基因片段编码的氨基酸序列分析本研究设计S基因片段长度为1582bp，编码528个氨基酸。分析氨基酸序列的变异情况发现，毒株ZQ-D-L和SG的第1～12位氨基酸缺失，毒株Hb、GXn、Gx和S-H的第59～62位氨基酸缺失，毒株Heyuanwuchuan、Hen、GXn的第143～144位氨基酸缺失，毒株Gx的第142～144位氨基酸缺失，毒株Hb的第161～162位氨基酸缺失；毒株Hb、GXn、Gx、S-H在第163～164aa位存在氨基酸的插入（163Q、164D），毒株ZQ-D-L和MaoMing依次在277aa处和306aa处存在氨基酸的插入（277F、306S）；分离的大部分株毒株有14处明显的氨基酸突变位点,分别为348aa（I→T）、368～370aa（L→P、P→S、S→L）、397aa（S→F）、422aa20 （A→D）、432aa（S→L）、444aa（M→T）、446aa（L→Q）、448aa（F→S）、460aa（S→L）、476aa（I→T）、498aa（L→P）、500aa（E→Q）、509aa（F→L）、524aa（T→I）（图2.6a~2.6c）。图2.4aS基因片段氨基酸序列分析21 图2.4bS基因片段氨基酸序列分析22 图2.4cS基因片段氨基酸序列分析2.2.7M基因遗传进化分析对扩增得PEDVM基因RCR产物送广州天一辉远公司进行测序，测序结果明白为PEDVM基因序列。运用Mega6.0生物分析软件对所测得的32株毒株与国内外具有代表性的23株毒株进行遗传进化分析，构建遗传进化树如图2.7所示：从整个进化树的的详细分支分析，以欧洲毒株CV777为代表的PEDV经典毒株所处的G1分支和以美国毒株ISU13-1938E-IN-passage3为代表的PEDV变异毒株所处的G2分支；本实验所测得的32株毒株中的31株位于G2分支，其中以贵州毒株Gz为代表的19株毒株位于以美国毒株ISU13-1938E-IN-passage3为代表的亚G2-2分支中，其余的12株毒株以清远毒株Qinyuanwf为代表毒株位于G2-1分支中，而湖北毒株Hb位于以欧洲毒株CV777为代表的G1分支中。23 图2.5M基因遗传进化分析图注：●标注的为本实验所测毒株2.2.8M基因核苷酸序列及编码的氨基酸序列分析用DNAStar软件对所测得的32株PEDV的M基因进行核苷酸序列同源性分析，本研究所测毒株M基因核苷酸序列之间的同源性为97.1%～100%，与韩国毒株VirulentDR13、越南毒株VAP1113-1、美国毒株OH851、欧洲毒株CV777等参考毒株的同源性为96.0%～100%。对其编码氨基酸序列同源性分析，本研究所测毒株的氨基酸序列同源性为96.5～100%，与参考毒株的同源性为95.2%～97.2%（图2.6）。对本研究所测毒株与参考毒株氨基酸序列对比分析，部分所测毒株氨基酸位点发生突变，4个突变明显的位点为17aa（E→Q）、47aa（A→V）、196aa（G→S）、218aa（S→A）（图2.7a~2.7b）。24 图2.6M基因氨基酸同源性分析图2.7aM基因氨基酸序列分析25 图2.7bM基因氨基酸序列分析2.2.9ORF3基因遗传进化分析运用DNAStar软件对本研究测得PEDVORF3基因核苷酸序列同源性分析，构建遗传进化树(如图2.8)，14株毒株位于以CV777毒株为代表的G1分支中，18株毒株位于以OH851毒株为代表的G2分支中。图2.8ORF3基因遗传进化分析图注：▼标注的为本实验所测毒株26 2.2.10ORF3基因核苷酸序列及编码氨基酸同源性和氨基酸序列分析对本研究所测毒株同源性分析,所测毒株之间的ORF3基因核苷酸序列同源性为89.3%～100%，与参考毒株的核苷酸序列同源性为59.7%～100%；本研究所测毒株之间的氨基酸序列同源性为89.8%～100%，与参考毒株氨基酸序列同源性为59.6%～100%（图2.9）。对所测得毒株的ORF3基因编码的氨基酸序列分析，毒株Hb第81～99位氨基酸缺失，多株毒株氨基酸序列存在6个突变区，其突变位点为25aa（L→S）、70aa（I→V）、80aa（V→F）、107aa（C→F）、168aa（D→N）和182aa（H→Q）,其它少数区域存在氨基酸突变（图2.10a~2.10b）。图2.9ORF3基因氨基酸同源性分析图2.10aORF3基因氨基酸序列分析27 图2.10bORF3基因氨基酸序列分析2.3讨论自1971年PED在英格兰爆发以来，该病迅速蔓延至欧洲其它国家，疫情造成重大经济损失。随着人们对该疾病的进一步研究，1978年Chasey等人（Chaseyetal.,1978）分离出第一株PEDV毒株，并命名为CV777。中国最早于1971年上海地区爆发PED，但鉴于当时临床症状等其他因素，大家称之为疑似TGE，直到1980年，科研人员用免疫组化等技术证实其为PED。PED在国内第一次大爆发发生于2010年，当时出现以哺乳仔猪腹泻、脱水和呕吐等临床症状以及高死亡率为特征的疾病（Panetal.,2012），给国内养殖业造成严重的打击。PEDV是单链RNA病毒，与其他冠状病毒的形态特征相同，病毒以出芽的方式通过胞浆内膜进行装配（Deboucketal.,1981）。PED临床症状最主要的特点就是仔28 猪水样腹泻，各个日龄的猪只均易感染此病，给养猪生产带来较大麻烦，虽然疫苗免疫起到一定的保护效果，但是随着该病毒的变异和重组，疫苗免疫已很难达到预期效果。本研究从采集的37份样品中检测出32份PEDV阳性样品，阳性率为86.49%，这表明我国内地PEDV的疫情比较严重。本研究通过对PEDVS基因片段、M基因和ORF3基因的遗传进化分析，进一步了解中国内地PEDV的流行情况，为以后猪场疫苗的选择和生物安全防控措施提供理论依据（Sunetal.,2014）。PEDV毒株S基因片段遗传进化分析表明：本研究所测得的32株毒株分布于G1和G2两个分支中，中国内地主要流行与毒株CH/JXJA/2017相近的G2-2-2-2亚型毒株，这26株毒株与华中农业大学肖少波试验室分离的高致病性变异毒株AJ1102亲缘关系较近（毕静，2013），表明本研究所采集病料的部分猪场免疫AJ1102株疫苗较为合适，毒株Qinyuanwf和毒株SG与越南毒株VAP1113-1亲缘关系较近，且与美国变异毒株ISU13-19338E-IN-passage3和USCollorado302013亲缘关系较近；G1-1亚型中的毒株Hb与韩国毒株attenuatedDR13亲缘关系较近，而G1-2亚型中毒株Gx、S-H和GXn则和美国毒株OH851亲缘性较近。利用生物学分析软件对本研究所测PEDV毒株和参考毒株进行S基因核苷酸和氨基酸序列的同源性分析，少数毒株序列之间差异性明显，而与参考毒株序列相比，其核苷酸和氨基酸的同源性差异较明显，这也说明了PEDVS基因较容易发生变异。对本研究所测毒株氨基酸序列分析，部分毒株氨基酸序列发生缺失或插入，所测得32株毒株都有氨基酸位点的突变，其中毒株ZQ-D-L和SG在第1～12位氨基酸连续缺失，毒株Hb、GXn、Gx和S-H在第59～62位氨基酸连续缺失，毒株Heyuanwuchuan、Hen、GXn在第143～144位氨基酸发生缺失，毒株Gx在第142～144位氨基酸缺失，毒株Hb在第161～162aa位氨基酸缺失；毒株第Hb、GXn、Gx、S-H在163～164aa位存在插入（163Q、164D），毒株ZQ-D-L和MaoMing依次在277aa处和306aa处存在插入（277F、306S），32株毒株的氨基酸序列有14处明显的氨基酸突变点,依次为348aa（I→T）、368～370aa（L→P、P→S、S→L）、397aa（S→F）、422aa（A→D）、432aa（S→L）、444aa（M→T）、446aa（L→Q）、448aa（F→S）、400aa（S→L）、476aa（I→T）、498aa（L→P）、500aa（E→Q）、509aa（F→L）、524aa（T→I）。对PEDVS基因的遗传进化分析和氨基酸序列分析，进一步说明PEDV易变异的特点，这与近年来PEDV流行特点相符。由于PEDV的S基因能诱29 导机体产生中和抗体（孙东波等，2007），所以S蛋白是PEDV疫苗研究的热点，对其功能的研究尤为重要（郑芳园，2014）。人们常把S基因片段划分为S1和S2进行研究，S2段比较保守，基因序列一般不会发生缺失，插入或者突变等，但S1段基因就比较容易发生遗传变化，这也是PEDV防控过程中的难点所在。Lee等人（Leeetal.,2010）对韩国的不同PEDV毒株的S基因N端1100bp序列和S基因序列分别比对分析，两种方法的分析结果一致，这也说明S基因N端1100bp可用于PEDV毒株的分子流行病学调查和疫苗株的筛选（Parketal.,2011），所以本试验对S基因片段的前1582bp进行分子流行病学调查的研究。对PEDVM基因进行进行遗传进化分析，本研究所测毒株中只有毒株Hb位于G1型中，其与韩国株attenuatedDR13亲缘关系较近，本研究所测其余31株都在G2型中。对其氨基酸和核苷酸序列的同源性分析，同源性都在95%以上，对M基因编码的氨基酸序列比对分析，只有4处氨基酸位点存在明显突变，突变点分别为17aa（E→Q）、47aa（A→V）、196aa（G→S）、218aa（S→A），说明M基因比较保守，变异不大，这与Yu等的研究相一致（Yuetal.,2005）。对PEDVORF3基因遗传进化分析，本研究所测32株毒株中的18株毒株与美国弱毒株OH851同源性较高，都位于G2型中；本研究所测其它14株毒株以Shantou为代表与亚洲变异毒株AJ1102（强毒株）同源性较高，都位于G1型中，这说明我国内地PEDV流行情况比较复杂。对所测得的ORF3基因进行核苷酸和氨基酸的同源性分析，所测毒株与参考毒株的核苷酸序列同源性差异较大，本研究所测毒株之间核苷酸序列同源性为89.3%～100%，与参考毒株之间的同源性为59.7%～100%；本研究所测毒株之间氨基酸序列同源性为89.8%～100%，与参考毒株氨基酸序列同源性为59.6%～100%；对ORF3基因编码的氨基酸序列比对分析发现，毒株Hb的M基因长度只有276nt，其编码的氨基酸序列第81aa～99aa连续缺失，与韩国弱毒株attenuatedDR13高度同源；从ORF3氨基酸序列比对分析图可以看出，本研究所测大多数毒株氨基酸序列存在6个突变区，其突变位点为25aa（L→S）、70aa（I→V）、80aa（V→F）、107aa（C→F）、168aa（D→N）和182aa（H→Q）；其它少数区域存在氨基酸突变。从近年来PEDV的流行情况来看，以往是冬春季节易爆发PEDV，现在的发病情况没有明显的季节性规律，一年四季均可发生。在发生PEDV疫情的猪场，哺乳30 仔猪的死亡率可达到100%，给养殖企业带来了巨大的经济损失（李明波等，2016）。做好疫苗接种和生物安全是目前防控PEDV的有效方法。本研究通过对PEDV的S基因片段、M基因和ORF3基因进行遗传进化分析以及氨基酸序列对比，研究结果表明中国境内PEDV流行毒株以变异毒株为主，且大部分毒株的S基因序列存在较多的插入或缺少，少量毒株的ORF3基因序列存在缺失，此外M基因较为保守。本研究调查了中国境内PEDV的流行情况，为猪场进行疫苗的筛选提供了理论依据。第三章PEDV调控细胞因子机制的研究3.1材料和方法3.1.1材料3.1.1.1菌株、毒株、细胞、载体E.coliDH5α、293T细胞、Vero细胞、VeroE6细胞，PCMV-HA真核表达载体、PCMV-PEDV-E、PCMV-PEDV-S2、PCMV-PEDV-S1、PCMV-PEDV-ORF3、PCMV-PEDV-nsp1、PCMV-PEDV-nsp4、PCMV-PEDV-nsp16、PCMV-PEDV-nsp2、PCMV-PEDV-M质粒由本实验室保存。PEDV毒株GDgh-F23由华南农业大学国家生猪种业工程技术研究中心刘燕玲老师馈赠。PCMV-NF-κΒ-Luc、PCMV-TK-Luc质粒均由本实验室保存。3.1.1.2主要试验试剂和常用试剂配制方法限制性内切酶PmeI、MluI购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司；感受态细胞DH5α购自北京全式金生物(TransGenBiotech)有限公司；FAM-siRNA购于上海吉玛制药技术有限公司；JSH-23NF-κΒ抑制剂购于Selleck中国有限公司；TMLipofectamine®LTXandPLusReagent、Lipofectamine®RNAiMAXReagent购于广州昂科生物科技有限公司DNA胶回收纯化试剂盒EZNATMGelExtractionKit购自美国PROMEGA生物技术公司；高纯度质粒小提中量试剂盒（离心柱型）TIANpureMiniPlasmidKit购自天根生物有限公司；中提质粒试剂盒PureYiedPlasmidMidiprepSystem购自美国PROMEGA生物技31 术公司；琼脂糖购于sigma生物技术有限公司；T4DNA连接酶购于NEB（北京）有限公司。LB液体培养基：将5g酵母提取物（YeastExtract）、5gNaCl、10g胰蛋白胨（Tryptone）置于烧杯中，加入600mLddH2O，完全溶解后用5mol/L的NaOH将溶液pH调至7.0～7.2，定容至1000mL，在121℃下蒸汽灭菌25min，室温保存。LB固体培养基：向100mLLB液体培养基中加入1.5g琼脂粉，121℃蒸汽灭菌21min，等温度降至40℃左右时，加入相应抗生素，混匀后缓慢倒入平皿中，等培养基凝固后，倒置放于4℃保存备用。氨苄青霉素(Amp)：将6.98gAmp粉剂加入到20mLddH2O中，完全溶解后，用0.22μm滤膜过滤，分装，于-20℃储存备用，其工作浓度为0.1g/mL。电泳缓冲液（50×TAE）：将242gTrisbase加入到750mLddH2O中，加入57.1mL冰醋酸，100mL0.5mol/LEDTA（pH8.0），定容至1000mL。PBS缓冲液：将8gNaCl、0.2gKCl、1.44gNa2HPO4、0.24gKH2PO4置于烧杯中，加入800mLddH2O，完全溶解后定容至1000mL，121℃下蒸汽灭菌21min，室温保存。3.1.1.3主要仪器设备水平电泳系统：北京六一仪器厂JY-CX2B型垂直电泳槽：北京六一仪器厂37℃恒温培养箱：广州南方生化医学仪器有限公司SW-CJ-1FD型洁净工作台：苏州安泰空气技术有限公司常温离心机：上海安亭科学仪器厂低温冷冻冰箱：日本SANYO公司凝胶成像分析系统：日本AlphaMaster公司PCR扩增仪：美国AppliedBiosystems公司低温高速离心机：BECKMANAvantiTM型OLYMPUS-CX21生物学显微镜：日本奥林巴斯公司JY92-2D超声波破碎仪：宁波新芝科技研究所HVE-50型高压灭菌锅：日本Hirayama公司32 UP50超纯水仪：德国密理博公司DW-HW50型﹣80℃超低温冰箱：美国Thermo公司TD-20/20luminometer多功能酶标仪：美国Thermo公司3.1.1.4生物学软件用NCBI/blastp（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blastp/）在线软件分析核苷酸序列相似性。生物信息学分析软件：DNAstar、ClustalX、GraphPadPrism6、MEGA6.0、Primer5.0和Oligo6.0。3.1.2方法3.1.2.1引物设计利用Primer5.0和Oligo6.0生物学分析软件，根据NCBI上GenBank发布的序列，设计本实验所需的引物，引物序列见表3.1~3.5。表3.1猪细胞因子扩增引物引物名称引物序列(5＇-3＇)扩增长度IL6-FATGAACTCCCTCTCCACAAGC638bpIL6-RCTACATTATCCGAATGGCCCTIL-8-FATGACTTCCAAACTGGCTGTT301bpIL-8-RCTGCTGTTGTTGTTGCTTCTCTNFα-FATGAGCACTGAGAGCATGATCC696bpTNFα-RCAGGCAATGATCCCAAAATACCL2-FATGAAGGTCTCTGCAGCCCTC297bpCCL2-RAGGCTTCGGAGTTTGGTTTTTCXCL10-FATGAACCAAAGTGCTGTTCTTAT312bpCXCL10-RTGCTTCTCTCTGTGTTCGA33 表3.2猴的基因细胞因子荧光定量引物名称正向引物（5＇-3＇）Acting-FGACGTGGACATCCGTAAAGACActing-RAAGCATTTGCGGTGGACGIL-6-FCTTCGGTCCAGTTGCCTTCTIL-6-RGCCTCTTTGCTGCTTTCACATNF-α-FCCTCTTCTCCTTCCTGCTCGTNF-α-RGGCTTGTCACTTGGGGTTCIL-8-FCAGCCTTCCTGCTTTCTGCIL-8-RCACAAACTTCTCCACAACCCTCXCL-10-FCATTCTGATTTGCTGCCTTGTCXCL-10-RAGACCTTTCCTTGCTAACTGCTCCL-2-FCTCGCTCAGCCAGATGCACCL-2-RGCTTGGGGTCAGCACAGAT表3.3人的基因荧光定量引物名称正向引物（5´-3´）Acting-FAGAGCCTCGCCTTTGCCGATCCActing-RCATGCCGGAGCCGTTGTCGACIL-6-FCATTCTGCCCTCGAGCCCACCIL-6-RGGCAGCAGGCAACACCAGGATNF-α-FCCCTCTGGCCCAGGCAGTCATNF-α-RATGGGTGGAGGGGCAGCCTTIL-8-FCGTGGCTCTCTTGGCAGCCTTCIL-8-RTTCCTTGGGGTCCAGACAGAGCTCCXC-10-FCACCATGAATCAAACTGCGACXC-10-RGCTGATGCAGGTACAGCGTCCL-2-FGCCTCCAGCATGAAAGTCTCCCL-2-RAGGTGACTGGGGCATTGAT34 表3.4PEDV反转录引物引物名称引物序列5´-3´PEDV-RGCCGTGCCACCACCATCAACAGCT表3.5PEDV荧光定量引物引物名称引物序列5＇-3＇位点PEDV-FAACAACCTTCCAATTGGCATT203～203ntPEDV-RAACCCAGAAAACACCCTCAGT274～294nt3.1.2.2PEDVTCID50的测定1、在96孔板中铺满单层Vero细胞，放入含有5%CO2的37℃恒温箱中，培养5至细胞数量达到2～3×10个/mL。2、用含有的2%胎牛血清的DMEM（培养液提前在37℃的恒温箱回温）将-PEDV病毒液体吸入到高压过的EP管中并按10倍的稀释共设8个梯度，分别为101-8~10.3、用PBS润洗3次Vero细胞，将稀释好的病毒接种到96孔培养板中，每一稀释度接种一纵排，共8个孔，每个孔加入100mL病毒稀释液，第9纵排的8个孔设置成阴性对照。4、每隔6小时观察一次细胞产出病变的孔数（CPE），详细记录观察结果，直至阴性对照细胞衰老为止。5、利用Reed-Muench两氏法计算待测病毒的TCID50值。3.1.2.3细胞总RNA的提取1：收集细胞：弃去培养液，直接把细胞冻融在-80℃的冰箱。2：裂解处理：加人600mL裂解液RL（加入6mLβ巯基乙醇，按RL中加入β巯基乙醇至终浓度为1%）。3：将所有溶液转移至过滤CS（过滤柱CS放在收集管中），12000r/min离心2min，收集滤液。4：向滤液中加入70%乙醇600μL，混匀（此时可能会出现沉淀），得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱CR3中（吸附柱CR3放入收集管中），12000r/min离心60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。35 5：向吸附柱CR3中加入350μL去蛋白液RW1，12000r/min离心60sec,倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。6：DNase中工作液的配制：取10μLDNase储存液（将DNaseN干粉溶解在550μLRNase-FreeddH2O，轻柔混匀，分装后-20℃贮存）放入新的RNase-Free离心管中，加入70μLRDD溶液，轻柔混匀。7：向吸附柱CR3中央加入80μL的DNase混工作液，室温放置15min.8:向吸附柱CR3中加入350μL去蛋白液RW1，12000r/min离心60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。9：向吸附柱CR3中加入500μL漂洗液RW(使用前加入无水乙醇)，室温静止2min，12000r/min离心60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。10.重复步骤9.11.12000r/min离心2min，倒掉废液。将吸附柱CR3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。12.将吸附柱CR3转入一个新的RNase-Free离心管中，加入80μLRNase-FreeH20室温放置2min，12000r/min离心2min，得到RNA溶液。3.1.2.4反转录CDA的合成表3.6反转录反应体系(1)反应体系体积dNTPMixture1μLPrimerR2μLddH2O6μLPEDVRNA6μLTotal15μL反应程序为72℃5min，冰浴2min。36 表3.7反转录反应体系（2）反应体系体积第一步反应体系15μL5×RTBuffer4μLRNaseInhibitor0.5μLReverseTranscriptase0.5μLTotal20μL反应程序为42℃90min。3.1.2.5限制性内切酶双酶切反应表3.8双酶切体系反应体系体积限制性内切酶Ⅰ1μL限制性内切酶Ⅱ1μL目的质粒20μLddH2O18μL5×Buffer10μLTotal50μL反应程序为37℃过夜酶切。3.1.2.6PCR产物或酶切产物的电泳检测称取琼脂糖粉0.25g，将所称量的琼脂粉加入含25μLTBE缓冲液的锥形瓶中混匀，微波炉高温加热1min至琼脂粉充分溶解，在洁净的胶槽内放好梳子，待胶温度在55℃左右往胶内滴加2.5μLEB核酸染料，轻微震荡混匀，冷却至胶即将凝固时缓慢倒入胶板内，胶凝固后轻轻拔掉梳子。取适量的PCR产物或者酶切产物样品与适量的10×Buffer核酸染料混匀，轻轻加入梳孔中，同时加入2KDNAMarker做对照，以120U、120mA、15W的条件下电泳25min，在UV凝胶成像系统下观察和目的片段进行比较，鉴定结果正确后拍照保存。37 3.1.2.7酶切产物回收与纯化（1）将目的条带切下后置于1.5mLEP管中，向其中加入300µL的buffer，放置于60℃水浴锅中使胶融化。（2）将融化好的胶放于离心柱中，静置1min，12000r/min离心1min，弃掉2mL离心管底部的溶液。（3）向离心柱中加入300µL的buffer，12000r/min离心1min，弃掉2mL离心管底部的溶液。（4）向离心柱中加入700µL的washbuffer，12000r/min离心1min，弃掉2mL离心管底部的溶液。（5）向离心柱中加入400µL的washbuffer，12000r/min离心1min，弃掉2mL离心管底部的溶液。（6）将离心柱放入一个新的1.5mL的离心管中，向离心柱中加50µLelutionbuffer，静置1min，12000r/min离心1min，收集到的液体即为回收的PCR产物。3.1.2.8DNA片段与质粒载体的连接反应表3.9连接体系反应体系体积10×T4DNALigase1μLBufferT4DNALigase1μL目的质粒（已酶切）0.5μL载体质粒（已酶切）0.5μLTotal20μL反应程序为22℃4h。3.1.2.9连接产物的转化及鉴定取出冻存于-80℃冰箱的体积为100μL感受态细胞(DH5α)，放置于碎冰中让其自然融化，将目的DNA缓慢加入到感受态细胞悬液中，轻轻敲打离EP管底部以确保目的DNA均匀混合在感受态细胞中，放置冰浴45min后，将EP管置于42℃水浴中放置60sec，迅速转移EP管至至冰浴中，使细胞冷却2min，以确保目的DNA进入38 大肠杆菌DH5α中，向EP管中加入600µLLB液体培养基然后置于37℃180r/min摇床上震荡3h，3000r/min离心1min,弃去500µL上清溶液，菌体沉淀在无菌条件下+均匀涂抹在含有Amb抗性的LB固体培养基上。倒置培养14h，挑取长势良好的单个菌落进行PCR鉴定。3.1.2.10小提质粒1：柱平衡步骤：向吸附柱CP4中（吸附柱放入收集管中）加入500μL的平衡液BL，12000r/min离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。2：取10mL过夜培养的菌液加入离心管中，12000r/min离心1min，尽量吸取上清。3：向留有菌体沉淀的离心管中加入500μLBufferP1（已加入RNaseA），使用移液器或涡旋震荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀。4：向离心管中加入500μLBufferP2，温和地上下翻转6~8次使菌体充分裂解（温和地混合，不要剧烈震荡，以免打断基因组DNA，所用时间不应超过5min，以免质粒受到破坏）。5：向离心管中加入700μLBufferP3，立即温和地上下翻转6~8次，充分混匀，此时会出现白色絮状沉淀（BufferP3加入后应立即混合，避免产生局部沉淀）。6：将上一步收集的上清液分次加入过滤柱CS（过滤柱放入收集管中），12000r/min震荡离心2min，小心地将离心后收集管中得到的溶液分次加入吸附柱CP4中（吸附柱放入收集管中）。7：12000r/min离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP4放入收集管中。8：向吸附柱CP4中加入500μL去蛋白液PD，12000r/min离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP4放入收集管中。9：向吸附柱CP4中加入600μL漂洗液PW（已加入无水乙醇），室温静置5min，12000r/min离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP4放入收室集管中。10:步骤9重复一次。11：将吸附柱CP4重新放回收集管中置于12000r/min离心2min，去除吸附柱中残余的漂洗液。12：将吸附柱CP4置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加150μL洗脱液TB，室温放置2min，12000r/min离心1min。39 3.1.2.11中提质粒质粒提取按照AxyPrep公司质粒小提试剂盒说明书进行：（1）将3mL菌液分装于2个1.5mL的离心管中，12000r/min离心1min，弃尽上清。（2）向离心管中加入250µL的bufferS1（加入RNaseA），重悬菌体沉淀，不能留有小块菌体。（3）向离心管中加入250µL的bufferS2，温和并充分的上下翻转4～6次，裂解菌体。（4）向离心管中加入350µL的bufferS3，温和并充分的上下翻转6～8次，12000r/min离心10min。（5）取离心后的上清溶液放置于制备管中，12000r/min离心1min。弃掉滤液。（6）向制备管中加入500µL的bufferW1，12000r/min离心1min。弃掉滤液。（7）向制备管中加入700µL的bufferW2，12000r/min离心1min。弃掉滤液。（8）向制备管中加入400µL的bufferW2，12000r/min离心1min。弃掉滤液。（9）向制备管中加入50µL的elutionbuffer，静置1min。收集的液体即为所要提取的质粒。3.1.2.12真核表达质粒的构建与鉴定用细胞核酸提取试剂盒提取细胞总RNA，然后反转录成cDNA后使用PCR方法进行扩增，PCR产物用胶回收试剂盒进行回收，连接载体后进行转化，涂板，挑生长状态良好的菌体进行菌落PCR鉴定，PCR阳性目的产物送测序，鉴定正确后，扩摇200mL菌液14h，用中提质粒试剂盒提取质粒，质粒进行双酶切鉴定，测得提取的质粒浓度后做好标记放在-80℃的冰箱保存。3.1.2.13细胞转染56将293T细胞以1×10个/孔的量接种到24孔细胞培养板或2×10个/孔的量接入12孔细胞培养板中，待单层细胞长至50%～60%时进行细胞转染试验。转染之前先更换细胞培养液，然后进行细胞转染液的配制。具体操作按照Lipofectamine®LTXTMandPLusReagent转染试剂盒说明书进行。其步骤如下：（1）细胞转染液的配制：准备无菌的1.5mLEp管，先按照100µL/孔加入24孔板的体积量计算或250µL/孔加入12孔板的体积量计算无血清培养基OPTI-MEM40 所需体积，构建的目的质粒DNA或siRNA分子，然后再向其中加入0.625µL或1.25µL的PLus，轻轻混匀后室温静置7min；然后加入1.25µL或2.5µLLTX，轻轻混匀后室温静止26min。（2）按照24孔板所需体系（100µLOPTI-MEM、目的质粒DNA或siRNA分子500ng、PCMV-NF-κΒ-Luc200ng、PCMV-TK-Luc10ng、0.625µLPLus、1.25µLLTX）或12板/孔所需体系（250µLOPTI-MEM、目的质粒DNA或siRNA分子1.25µg、1.25µLPLus、2.5µLLTX）均匀加入每个孔中。（3）在转染后不同的时间点收集上清和细胞。3.1.2.14双荧光素酶报告试验6将293T细胞以2×10个/孔的量接入24孔细胞培养板中，待单层细胞长至50%～60%后，按步骤3.1.2.13操作步骤共转染相关的荧光素酶报告质粒或内参质粒以及一些真核表达质粒。在规定时间内进行双荧光素酶检测实验，具体操作过程包括:（1）裂解细胞：提前取出试剂盒中的1×Buffer细胞裂解液，恢复至室温，加100mL裂解液，静止10分钟使细胞充分裂解；（2）收集细胞上清：小心收集，不要收集到细胞碎片；（3）测定荧光素酶活性：取50µL上清液加入到50µL试剂盒中预先配好的LARII中，在多功能酶标仪上检测萤火虫荧光素酶(Fireflyluciferase)活性。之后加入50µL试剂盒中预先配好的Stop&Glo®Reagent，检测海肾荧光素酶(Ranillaluciferase)的活性。根据检测数据计算其相对活性。3.1.2.15荧光定量RT-PCR检测基因mRNA的水平将转染后的细胞按照TIANGENRNAprepure培养细胞/细菌总RNA提取试剂盒说明书提取细胞的总RNA，反转录反应合成cDNA，以cDNA为模板进行RealtimePCR扩增，用Vazyme公司RealtimePCRMasterMix(SYBRGREEN)试剂盒检测细胞中特定基因mRNA的表达水平。荧光定量PCR反应体系如下所示：41 表3.10荧光定量扩增体系扩增体系体积2×Mastermix10uLRNasefreeddH2O7.8uLPrimerF0.6μLPrimerR0.6μLcDNA1μLTotal20μL反应条件为：StepⅠ：95℃30s；StepⅡ：95℃10s，60℃60s，34个循环。3.1.2.16siRNA干扰试验设计本实验所研究每个细胞因子的3个位点的siRNA分子，送上海吉玛生物制药技术有限公司合成，其siRNA分子详情见表3.12。42 表3.11siRNA干扰分子名称引物序列（5＇-3＇）IL6-Macaca-135-FGCCACUGACCUCUUCAGAATTIL6-Macaca-135-RUUCUGAAGAGGUCAGUGGCTTIL6-Macaca-313-FGGAUUCAAUGAGGACACUUTTIL6-Macaca-313-RAAGUGUCCUCAUUGAAUCCTTIL6-Macaca-472-FGCAAAGAAUCUAGAUGCAATTIL6-Macaca-472-RUUGCAUCUAGAUUCUUUGCTTIL-8-Macaca-80-FGGCAGCCUUCCUGCUUUCUTTIL-8-Macaca-80-RAGAAAGCAGGAAGGCUGCCTTIL-8-Macaca-125-FGCCAAGGAGUGCUAAAGAATTIL-8-Macaca-125-RUUCUUUAGCACUCCUUGGCTTIL-8-Macaca-308-FGAGGGUUGUGGAGAAGUUUTTIL-8-Macaca-308-RAAACUUCUCCACAACCCUCTTCCL2-Macaca-65-FUCGCUCAGCCAGAUGCAAUTTCCL2-Macaca-65-RAUUGCAUCUGGCUGAGCGATTCCL2-Macaca-101-FGCUGCUAUAACUUCACCAATTCCL2-Macaca-101-RUUGGUGAAGUUAUAGCAGCTTCCL2-Macaca-257-FCCAUGGACCACCUGGACAATTCCL2-Macaca-257-RUUGUCCAGGUGGUCCAUGGTTCXCL10-Macaca-42-FGACUCUAAGUGGUAUUCAATTCXCL10-Macaca-42-RUUGAAUACCACUUAGAGUCTTCXCL10-Macaca-101-FGCAUUAGUAAUCAACCUGUTTCXCL10-Macaca-101-RACAGGUUGAUUACUAAUGCTTCXCL10-Macaca-262-FGCAGUUAGCAAGGAAAGGUTTCXCL10-Macaca-262-RACCUUUCCUUGCUAACUGCTTTNFα-Macaca-261-FGCCUGUAGCCCAUGUUGUATTTNFα-Macaca-261-RUACAACAUGGGCUACAGGCTTTNFα-Macaca-479-FCCGUCUCCUACCAGACCAATTTNFα-Macaca-479-RUUGGUCUGGUAGGAGACGGTTTNFα-Macaca-675-FGGUCUACUUUGGGAUCAUUTTTNFα-Macaca-675-RAAUGAUCCCAAAGUAGACCTT43 按照说明书稀释后保存-20℃冰箱，待单层Vero细胞培养至50%~60%时，转染sinRNA分子，24h后收取细胞沉淀，用细胞核酸提取试剂盒提取细胞总RNA，反转录为cDNA，进行荧光定量PCR试验，根据荧光定量PCR结果确定每组细胞因子中干扰效果最佳的siRNA分子以便后续试验。3.2结果3.2.1PEDV感染Vero细胞后细胞因子的表达情况-4.51：检测PEDVGDgh-F23TCID50，检测结果为10TCID50/mL；2：以0.01MOI的剂量将GDgh-F23毒株接至Vero细胞上（6孔板上）每个时间点做3个重复；3：用核酸提取试剂盒对细胞进行总RNA的提取并用随机引物反转录为cDNA；4：荧光定量测得各细胞因子的表达情况。结果如图3.1所示：PEDV感染Vero细胞后12h、24h、36h、48h和60h，TNFα和IL6mRNA水平显著上调（3.1c、3.1e）；PEDV感染Vero细胞后36h、48h和60h，IL8mRNA水平显著上调（3.1d）；PEDV感染Vero细胞后12h、24h、36h和60h，CCL2mRNA水平显著上调（3.1a）；PEDV感染Vero细胞后24h、36h、48h和60h,CXCL10mRNA水平显著上调（3.1b）。44 abcde图3.1Vero细胞感染PEDV（12h、24h、36h、48h、60h）细胞因子mRNA表达水平图注：（a）CCL2，(b)CXCL10，（c）IL6，（d）IL8，(e)TNFα3.2.2PED病毒蛋白作用NF-κΒ的研究293T单层细胞培养至铺满平板50%～60%的状态时，将含有10%胎牛血清的DMEM细胞培养液放在37℃恒温箱回温，更换细胞培养液后，按照3.1.2.13中的转45 染步骤将各PCMV-HA质粒，PEDV病毒蛋白真核质粒、PCMV-NF-κΒ-Luc质粒、PCMV-TK-Luc质粒转染至293T细胞中，24h后收集细胞。按3.1.2.14中的荧光素酶报告基因试验操作步骤进行操作，试验样品数值在多功能酶标仪读取保存。对PEDV各病毒蛋白的荧光素酶试验结果利用GraphPadPrism6.0生物学软件分析，筛选出激活NF-κΒ的PED的病毒蛋白nsp4，结果如图3.2所示。ab图3.2NF-κΒ荧光表达量图注：（a）转染PCMV-HA质粒、PCMV-NF-κΒ-Luc质粒及PCMV-TK-Luc质粒,PCMV-PEDV-M质粒、PCMV-NF-κΒ-Luc质粒及PCMV-TK-Luc质粒，PCMV-PEDV-ORF3质粒、PCMV-NF-κΒ-Luc质粒及PCMV-TK-Luc质粒，PCMV-PEDV-nsp15质粒、PCMV-NF-κΒ-Luc质粒及PCMV-TK-Luc质粒，PCMV-PEDV-M质粒、PCMV-NF-κΒ-Luc质粒及PCMV-TK-Luc质粒（b）转染PCMV-PEDV-HA质粒、PCMV-NF-κΒ-Luc质粒及PCMV-TK-Luc质粒，PCMV-PEDV-nsp1质粒、PCMV-NF-κΒ-Luc质粒及PCMV-TK-Luc质粒，PCMV-PEDV-nsp4质粒、PCMV-NF-κΒ-Luc质粒及PCMV-TK-Luc质粒3.2.3PEDV-nsp4病毒蛋白通过NF-κΒ信号通路作用于细胞因子的研究分别转染PCMV-HA空载质粒和PCMV-PEDV-nsp4质粒到293T细胞中，在转染后24h、36h、48h、60h四个时间点收集细胞上清和沉淀，细胞上清收集至新的RNase-Free离心管后冻存于-80℃冰箱。细胞用TIANGEN总RNA提取试剂盒提取总RNA，用promega反转录试剂盒把RNA反转录成cDNA，荧光定量PCR检测细胞因子CCL2、CXCL10、IL6、IL8和TNFα的表达量。如图3.3所示：PCMV-PEDV-46 nsp4病毒蛋白通过NF-κΒ信号通路上调CCL2、CXCL10、IL6、IL8和TNFα的表达量；CCL2和IL8在转染后60h上调最明显（3.3a、3.3b），CXCL10、IL6和TNFα的表达量在转染后48h上调最明显(3.3c、3.3d、3.3e)。abcde图3.3转染PCMV-PEDV-nsp4的293T细胞（24h、36h、48h、60h）细胞因子mRNA表达水平图注：（a）CCL2，(b)IL8，（c）CXCL10，（d）IL6，(e)TNFα47 3.2.4药物抑制NF-κΒ蛋白后细胞因子的表达情况51、收集对数期293T细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100μL3×10个/mL。2、5%CO2，37℃孵育，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板），加入浓度梯度的药物设4个梯度，每孔100μL，3个复孔.3、5%CO2，37℃孵育24小时，显微镜下观察。4、每孔加入20μLMTT溶液（1mg/mL、2mg/mL、5mg/mL、10mg/mL），继续培养4h，弃去培养液，小心用PBS润洗3遍，再加入含MTT的培养液。5、终止培养，小心吸去孔内培养液。6、每孔加入150μL二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在多功能酶标仪检测OD490nm处各孔的吸光值，检测结果如图3.4所示。图3.4JSH-23对细胞活力的影响如图3.4所示，NF-κΒ抑制剂JSH-23对293T细胞活性没有影响，继续开展试验。293T单层细胞铺满孔板的60%左右时，将含有10%胎牛血清的DMEM细胞培养液放在37℃恒温箱回温，更换细胞培养液后，按照3.1.2.13中的转染步骤将PCMV-PEDV-nsp4病毒质粒和NF-κΒ抑制剂转染到293T细胞，转染后第48h和60h两个时间点收取细胞，放在-80℃冰箱冻存。提取细胞总RNA，反转为cDNA，放置-80℃冰箱保存。检测细胞因子表达水平如图3.5，CCL2（3.5a）、CXCL10(3.5b)、IL8(3.5d)、TNFα(3.5e)和IL6(3.5c)表达量下调，与图3.3中PEDV-nsp4病毒蛋白转染Vero细胞后上调CCL2（60h）、CXCL10(48h)和IL8(60h)以及TNFα(48h)和IL6(48h)的表达量一致，说明PCMV-PEDV-nsp4病毒蛋白通过NF-κΒ信号通路上调CCL2、CXCL10、TNFα、IL6和IL8表达量。48 eegg1.5na1.5nahh**ccld****ldooff1.0A1.0ANNRRmm0260h1L0.5L0.5CC48hCXeCivtelaivte0.0la0.0Ren3Rn3o-2o-2CHCHSS-J-J44ppss-n-nVVDDEE-P-PVVMMCCPPabeg1.5e1.5gnnaah*h****ccldldof1.0o1.0fAANNRRmm60.580.5L48hLI60hIeeivtivtlalaeeR0.0R0.0n3n3o-2o-2CHCHSS-J-J44ppss-n-nVVDDEE-P-PVVMMCCPPcdegna1.5hc****ldof1.0AN48hRmαF0.5NTevtila0.0eRon3C-2HS-J4ps-nVDE-PVMCPe图3.5同时转入药物JSH-23和PVMV-PEDV-nsp4的293T细胞不同时间点细胞因子mRNA表达水平图注：（a）CCL2，(b)CXCL10，（c）IL6，（d）IL8，(e)TNFα49 3.2.5过表达细胞因子对病毒复制影响的研究在5个6孔板上培养VeroE6细胞，待6孔板的单层VeroE6细胞排满平板的60%左右时，将含有10%胎牛血清的DMEM细胞培养液放在37℃回温，弃去旧的细胞培养液，PBS润洗三次，更换细胞培养液，按照3.1.2.12操作步骤转染真核质粒pWPXL-CCL2、pWPXL-CXCL10、pWPXL-IL6、pWPXL-IL8和pWPXL-TNFα到细胞培养液中，pWPXL载体带有GFP标签，24小时后荧光显微镜下观看转染效果，如图3.7所示，所构建的5个细胞因子的真核质粒都成功转入VeroE6细胞中。图3.7不同细胞因子真核质粒转染VeroE6细胞荧光结果50 当VeroE6细胞铺满平板时，按MOI为0.01的剂量接种病毒GDgh-F23，接种24h后收集细胞和上清放置-80℃冰箱冻融后提取总RNA，反转录为cDNA后放置-80℃冰箱保存，利用荧光定量PCR方法检测PEDV的病毒含量。结果如图如图3.8所示：转染24h后，转入细胞因子真核质粒的PEDV的病毒载量（上清和细胞中）均低于对照组，其中转入真核质粒pWPXL-CCL2、pWPXL-CXCL10、pWPXL-IL8和pWPXL-TNFα的试验组中，上清和细胞中PEDV的病毒载量均低于对照组，但上清中的PEDV的病毒载量差异较显著（3.8a、3.8e、3.8b、3.8d）；转入真核质粒pWPXL-IL6细胞中的PEDV的病毒载量和上清中PEDV的病毒载量均低于对照组，且差异非常显著（3.8c）。以上结果表明细胞因子CCL2、CXCL10、IL6、IL8和TNFα通过某些途径促进免疫功能，进而抑制PEDV的复制。51 7.01087.0108***CCL2(cytoplasm)***CXCL10(cytoplasm)5.0108Con(cytoplasm)5.0108Con(cytoplasm)snss**iep3.0108CCL2(supernatant)iep3.0108CXCL10(supernatant)ooc1.0108Con(supernatant)c1.0108Con(supernatant)AAN3000000N3000000R***R***l***l***a2000000a2000000irirVV1000000100000000hhhh48482424HourspostinfectionHourspostinfectionab7.01087.0108IL6(cytoplasm)IL8(cytoplasm)5.0108***Con(cytoplasm)5.0108***Con(cytoplasm)s***s**iep3.0108IL6(supernatant)iep3.0108IL8(supernatant)ooc1.0108Con(supernatant)c1.0108Con(supernatant)AAN3000000N3000000R***R***l***l***a2000000a2000000irirVV1000000100000000hhhh48482424HourspostinfectionHourspostinfectioncd7.0108TNFα(cytoplasm)8***5.010nsCon(cytoplasm)siep3.0108TNFα(Supernatant)oc1.08Con(Supernatant)A10N3000000R***l***a2000000irV10000000hh4824Hourspostinfectione图3.8转染细胞因子真核质粒24hVeroE6细胞和上清PEDVmRNA拷贝数图注：（a）转入pWPXL-CCL2PEDVmRNA拷贝数，(b)转入pWPXL-CXCL10PEDVmRNA拷贝数，（c）转入pWPXL-IL6PEDVmRNA拷贝数，（d）转入pWPXL-IL8PEDVmRNA拷贝数，(e)转入pWPXL-TNFαPEDVmRNA拷贝数3.2.6IL6、IL8、TNFα、CXCL10和CCL2表达量下调对PEDV复制的影响利用Primer5.0和Oligo6.0生物学软件对猪的细胞因子CXCL10、CCL2、IL6、IL8和TNFα分别设计3个特异性siRNA干扰位点，小干扰siRNA分子由上海吉玛52 生物制药技术有限公司合成，按方法3.1.2.16中的操作步骤进行siRNA分子干扰试验，5种细胞因子干扰结果如图3.9。abcde图3.9小干扰RNA分子转染Vero细胞24h，检测其对应mRNA表达水平图注：（a）CXCL10，(b)CCL2，（c）IL6，（d）IL8，(e)TNFα筛选出siCCL2-65、、siCXCL10-101、siIL6-472、siIL8-125和siTNFα-2615个小干扰siRNA分子，待12孔板的单层Vero细胞铺满孔板60%左右转染小感染53 siRNA分子，转染前更换细胞培养液，每个试验组做两个重复，待转染siRNA分子后的单层Vero细胞铺满12孔板时，按0.01MOI剂量接种病毒GDgh-F23到12孔板，接种病毒24h后收集细胞和上清，分别提取总RNA。利用提取的核酸RNA为模板，反转录为cDNA保存，利用荧光定量PCR方法检测PEDV的含量。如图3.10：在接种病毒24h后收毒，siIL6-412、siTNFα-261、siCCL2-65、siCXCL10-101和siIL8-125干扰过的细胞沉淀和上清溶液中病毒载量均低于对照组，表明干扰IL6、TNFα、CCL2、CXCL10和IL8mRNA的合成，可以降低IL6、TNFα、CCL2、CXCL10和IL8对PEDV复制的抑制，从而表明IL6、TNFα、CCL2、CXCL10和IL8等细胞因子可能通过其相应的受体经过各种途径促进免疫功能，抑制PEDV的复制。54 7.0108***5.0108***4.01085.0108ss3.0108ie3.0108iepp2.0108ooc1.0108cA1.0108AN150000*N1200000***RRlla900000a100000irirV600000V5000030000000))t)t)))t)t)smsmnanmmnntatsstataplaplananaplaplaaatotorrtotornrnyypepeyypepe(c(cuu(c(cuu10on0(s(sL2n(s(sLC1onCCo2nCLCLoXCCCCCXi-Ci-CSi-Si-SSab5.01083.0108******4.010882.510s3.0108siep8iep2.0108o2.010ocAcA1.5108N1600000***N1800000***RRla1200000lairir1200000V800000V60000040000000))t)t)))t)t)mmnnmmnnsstatasstatalalaaalalaaapprnrnpprnrntotoeetotoeeyyppyypp(c(cuu(c(cuu6n(s(s8n(s(sILo6nILo8ni-CILoi-CILoSi-CSi-CSScd4.0108***3.0108siep2.0108ocA1.0108***N900000Rla600000irV3000000))t)t)mmnnsstatalalaaappnntotoereryypp(c(cuuFαon(S(SαnNCFoi-TNCSTi-Se图3.10小干扰RNA分子转染Vero细胞，接毒PEDV24h后上清和Vero细胞中PEDVmRNA拷贝数图注：（a）转入siCCL2-65PEDVmRNA拷贝数，(b)转入siCXCL10-101PEDVmRNA拷贝数，（c）转入siIL6-472PEDVmRNA拷贝数，（d）转入siIL8-125PEDVmRNA拷贝数，(e)转入siTNFα-261PEDVmRNA拷贝数55 3.3讨论PEDV毒株感染Vero细胞后，利用荧光定量PCR方法检测不同时间点Vero细胞因子的表达量，筛选出表达量上调的细胞因子CCL2、CXCL10、IL6、IL8和TNFα。构建PEDV各结构蛋白和非结构蛋白真核表达质粒，通过双荧光素酶报告基因试验筛选出PCMV-PEDV-nsp4病毒蛋白，该蛋白通过NF-κΒ信号通路上调细胞因子CCL2、CXCL10、IL6、IL8和TNFα的表达量。通过NF-κΒ药物抑制试验，进一步验证PEDV-nsp4病毒蛋白通过NF-κΒ通信号通路上调NF-κΒ下游CCL2、CXCL10、IL6、IL8和TNFα等细胞因子的表达量。通过siNRA干扰试验和过表达细胞因子CCL2、CXCL10、IL6、IL8和TNFα，分别从mRNA水平和蛋白水平上验证CCL2、CXCL10、IL6、IL8和TNFα表达量的上调能够抑制PEDV的病毒复制。IL6能够诱导淋巴B细胞的分化和Ig的分泌，以及增强体液免疫和再次免疫应答（Xingetal.,1998），且可以促进NK细胞的分化和杀伤活性，诱导T细胞成熟参与机体免疫应答，加深肝细胞急性蛋白（acutephaseprotein，APP）的合成，降低肝细胞白蛋白和转铁蛋白的合成。TNFα是机体炎症反应最初释放的一种炎性介质，能够活化单核细胞和巨噬细胞（朱桂英等，2008），提高其杀伤活性，活化中性粒细胞的吞噬能力增强其ADCC功能，调节其他细胞因子的合成和分泌参与到炎性反应中（Gordonetal.,1990），阻止病毒早期蛋白的合成（Nadkarnietal.,2007）。CCL2、CXCL10和IL8等趋化因子可以趋化淋巴细胞、巨噬细胞和中性粒细胞等到达炎性部位从而发挥杀伤或者吞噬等免疫功能（Qianetal.,2012）。本研究结果表明PEDV感染Vero细胞可以导致细胞因子CCL2、CXCL10、IL6、IL8和TNFα表达量上调，为研究PEDV引起细胞因子CCL2、CXCL10、IL6、IL8和TNFα表达量上调的具体机制，本研究构建PEDV病毒蛋白真核质粒，筛选出nsp4病毒蛋白通过NF-κΒ信号通路上调CCL2、CXCL10、IL6、IL8和TNFα等细胞因子表达量，通过siNRA干扰试验和过表达细胞因子CCL2、CXCL10、IL6、IL8和TNFα，进一步说明细胞因子CCL2、CXCL10、IL6、IL8和TNFα表达量上调抑制PEDV病毒粒子的复制。全文总结1、采集的37份病料中有32份检测为PEDV阳性，阳性率为86.49%。2、本研究测得来自中国内地的32个PEDV毒株中，有28株毒株属于G2-2亚型毒株，说明我国主要流行PEDV的变异毒株，另外4株毒株属于G1型，说明我国56 PEDV的流行情况比较复杂。3、与经典毒株CV777和亚洲变异毒株AJ1102相比较，本研究所测得32个PEDV毒株的S基因氨基酸序列存在多处氨基酸位点的缺失、插入或突变，说明我国南方地区PEDV的变异较多。4、PEDV感染Vero细胞后引起趋化因子CCL2、CXCL10、IL8、白细胞介素IL6和肿瘤坏死因子TNFα表达量上调。5、PCMV-PEDV-nsp4病毒蛋白可以通过激活NF-κΒ通信号通路上调趋化因子CCL2、CXCL10、IL8、白细胞介素IL6和肿瘤坏死因子TNFα的表达量。6、过表达细胞因子CCL2、CXCL10、IL6、IL8和TNFα抑制PEDV的复制。7、通过siRNA干扰试验，细胞因子CCL2、CXCL10、IL6、IL8和TNFα表达量下调有利于PEDV的复制。57 致谢两年的研究生生活即将结束，这两年来，感谢给予我帮助和支持的导师、同学和亲人朋友们，是你们给我的支持和帮助，让我走到了今天。在两年的研究生学习生涯中，我的导师宋长绪研究员在我的学习和生活上给予了我很大的关怀和帮助，宋老师严谨的治学态度，精益求精的工作作风，使我受益匪浅。本文是在导师宋长绪研究员和董建国老师精心的指导下完成的，他们对论文的选题、设计、实施和写作等各个方面倾注了大量的心血，在此论文完成之际，向辛勤培养我、支持我的老师们表示由衷的感谢和衷心的祝福。非常感谢国家生猪种业工程技术研究中心提供的科研平台，感谢课题组的吴珍芳教授、刘德武教授、李紫聪教授、蔡更元研究员、杨化强副研究员、杨杰副教授、洪林君副教授、顾婷老师、郑恩琴老师、徐铮老师及其他老师的谆谆教导！感谢动物科学学院其他老师对我的帮助。另外，感谢猪病功能实验室的刘燕玲老师、张乐宜老师、孟张丽老师，感谢他们为整个实验室默默的付出，让我顺利的开展科研工作和愉快的学习生活；感谢同师授业的申翰钦、郭亚星、周吉培、刘相聪、黎嘉豪、于林洋、张鹏飞、刘献辉、黄钊、班艳芳等同学，谢谢你们，是你们的帮助和陪伴让我在实验室度过了人生中最难忘的科研时光。感谢好友程珂、马涛、任行星、黄岩、陈林和黄鉴妮、刘晶晶等在我考研和读研期间给予的莫大帮助和支持。感谢我的舍友王远和王少磊两年来在学习和生活中给予我的帮忙和支持！感谢我的家人及朋友们，尤其是我爱人覃燕灵女士对我求学路上物质和精神的支持，我聪明可爱的儿子王许烨给予我精神上的鼓励，追求理想的道路上，有家人的陪伴我倍感欣慰，使我顺利完成我的学业。感谢工作所属单位广西农垦永新畜牧集团和良圻原种猪场各位领导、同事的关心与照顾，使我感到青春、主动、进取，对事认真、对人感恩、对物珍惜。最后，谨向百忙之中参加本文评阅和答辩的各位专家致以最诚挚的谢意！58 参考文献毕静.猪流行性腹泻病毒AJ1102株的分离、鉴定及其分子进化特征[D].华中农业大学,2013.曹丽艳.猪流行性腹泻病毒感染猪小肠上皮细胞抑制IFN-β产生及激活NF-κB机理研究[D].东北农业大学,2015.曾汝良,江振友.TNF-α,IFN-γ,IL-4,IL-10,IL-17在结核病患者血清中的表达及临床意义[J].中国医师杂志,2014,16(11):1530-1532.陈磊.Rig-I负调控AKT通路参与ATRA和IFNα合用诱导U937细胞增殖抑制、分化、凋亡和周期阻滞[D].西北农林科技大学,2010.陈奇英.干扰素诱导的DAI蛋白抑制乙型肝炎病毒复制的初步研究[D].复旦大学,2009.陈为歌,李寿斌.TNF-α与神经根炎症研究进展:泛中医论坛·思考中医2006,2006[C].董碧蓉,王曾礼.肿瘤坏死因子与临床[J].国际内科学杂志,1991(4):301-304.窦永喜.猪IFN-γ及其受体的生物学功能研究[D].中国农业科学院,2008.杜彩虹.猪冠状病毒性腹泻RT-PCR检测及猪传染性胃肠炎病毒分离鉴定[D].东北农业大学,2015.范正超.雷公藤红素增强TNF-α杀伤前列腺癌细胞及其机制探讨[D].军医进修学院;解放军总医院;解放军总医院;军医进修学院,2012.冯志新,姜平,王先炜,等.PRRSV与PCV2体外共感染对猪肺泡巨噬细胞免疫学功能的影响[J].中国预防兽医学报,2007,29(12):950-955.郭丹,吴曙光.IL—1受体复合物及信号转导[J].临床与病理杂志,1999(2):91-93.国畅廓,刘安文.IL-4/IL-4R与肿瘤关系的研究进展[J].生命的化学,2017(3):413-418.蒋伯诚.肿瘤坏死因子(TNF)[J].世界临床药物,1986(2).雷虹,曹雪涛,于益芝,等.腺病毒介导M-CSF和IFN-γ基因联合转染对巨噬细胞抗原提呈功能的影响[J].中国免疫学杂志,1998(6):399-402.李成文,邱录贵,严文伟,等.干扰素-α对LTBMC中慢性粒细胞白血病细胞作用的体外研究[J].中国肿瘤生物治疗杂志,1995,2(3):194-196.李建强.CloningandcharacterizationanalysisofspikeproteingeneofporcineCoronavirus[J].农业生物技术学报,2007,15(4).李康,郭强,王翠妮,等.M1和M2型巨噬细胞表型的比较分析[J].现代免疫学,2008,28(3):177-183.李明波,宋忠旭,董斌科,等.猪流行性腹泻的流行特点、诊断和防控技术[J].养猪,2016(5):89-91.李清芬,李卓娅,龚非力,等.比较跨膜型和分泌型TNF-α的体内杀瘤效应及其机制[J].中华微生物学和免疫学杂志,2001,21(6):615-618.李涛,陈正望.TNF-α在肿瘤中的作用[J].现代生物医学进展,2011,11(18):3586-3588.林卡莉,徐鹰,黄志华,等.香菇多糖对荷瘤鼠白细胞介素-2和白细胞介素-6表达及肿瘤细胞周期影响的研究[J].时珍国医国药,2010,21(6):1436-1437.59 刘新垣.干扰素的功能表达机制[J].医学分子生物学杂志,1981(6).柳亚楠,王永强,李晓齐,等.鸡IFN-γ基因的克隆表达及单克隆抗体制备:中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十六次学术研讨会,2015[C].吕志敢,郭政.肿瘤坏死因子的研究进展[J].山西医科大学学报,2006,37(3):311-314.马桂林,崔艳丽.重组HIVgp160疫苗对单核因子产生的影响[J].国际免疫学杂志,1991(6).茅奇峰.重组人SA-IFN-γ双功能融合蛋白的制备及其生物学鉴定[D].温州医学院,2011.齐铁雄,王长华,黄家红.新生儿缺氧缺血性脑病与IL-1、IL-18、IFN-γ和NOS的关系[J].中华现代儿科学杂志,2006.沈捷,田振华,马向华,等.伴与不伴脂肪细胞共培养状态下IL-6对人单核/巨噬细胞增殖和功能的影响:中华医学会第八次全国内分泌学学术会议,2009[C].孙东波,冯力,时洪艳,等.猪流行性腹泻病毒S蛋白中和表位区单克隆抗体的制备与鉴定[J].中国预防兽医学报,2007,29(11):887-890.孙振.猪流行性腹泻病毒荧光定量PCR方法和间接ELISA方法的建立与初步应用[D].山东农业大学,2014.田珂.甲真菌病患者血清IL-12、IFN-γ、NO、iNOS水平及其相关性的研究[D].河北医科大学,2008.王秋实,杨巧妮,王哲,等.IFN-γ对脐带间充质干细胞免疫调节功能和基因表达的影响:中国医师协会输血分会2013年输血学术年会,2013[C].王彦彬,周继臣,魏云强,etal..Animalinterferoncompoundanditsprepnandapplication:吴洁,王廉文,葛欣,等.儿童癫(疒间)发作期血清IL-8、IL-10、TGF-β1及TNF-α水平与临床的关系[J].临床儿科杂志,2008,26(6):501-504.吴阳阳,董燕,易浪,等.小檗碱对LPS、IL-4诱导的小鼠RAW264.7细胞分泌TNF-α、IL-10的影响[J].中药新药与临床药理,2014(3):268-272.谢雯,吴璐.干扰素的种类及特性[J].中国临床医生杂志,2012,40(4):11-13.严俊,姚堃,周瑶玺.T细胞活化、活化信号和IFN-γ诱生的关系研究[J].免疫学杂志,1992(2):95-98.殷震,刘景华.动物病毒学-2版[M].科学出版社,1997.于益芝,杨嗣坤,曹雪涛.IL-4抗肿瘤作用及其机理的研究进展[J].国际免疫学杂志,1993(4):208-212.张颖,白力,张文兰,等.去乙酰化酶抑制剂VPA对巨噬细胞极化过程的影响[J].中国免疫学杂志,2016,32(3):307-312.赵纪维,杨丽娟,孙雪峰.甲状腺肿瘤与细胞因子IL-4、IL-10、IFN-γ、IL-17关系研究进展[J].河北北方学院学报(自然科学版),2015(3):102-105.郑芳园.猪流行性腹泻病毒间接ELISA方法的建立和病毒样颗粒的构建及免疫特性分析[D].南京农业大学,2014.周春英,袁宝军.IL-10与TGF-β1在肺纤维化中的研究进展[J].中国实验诊断学,2011,15(11):1989-60 1990.周华,舒赛男,杨助峰,等.大蒜新素对巨细胞病毒感染小鼠脾细胞TGF-β1和IL-10的抑制作用[J].武汉大学学报(医学版),2010,31(5):580-583.朱桂英,徐斌,张捷,等.TNF-α活化人瘢痕疙瘩成纤维细胞NF-κB的实验研究[J].中国病理生理杂志,2008,24(1):165-168.朱仲丽,何浩,宋文刚.NKT细胞亚群及其功能研究进展[J].细胞与分子免疫学杂志,2012,28(2):215-216.BelemabedadaF,UchidaS,MartireA,etal..EfficienthomingofmultipotentadultmesenchymalstemcellsdependsonFROUNT-mediatedclusteringofCCR2.[J].CellStemCell,2008,2(6):566.Bing-XiaLU,QinYB,YingHE,etal..DetectionofPorcineEpidemicDiarrheaVirusfrom2011to2014inGuangxiProvineandSequenceAnalysisoftheirMGenes[J].ChinaAnimalHusbandry&VeterinaryMedicine,2015,42(3):549-557.BinnsMM,BoursnellME,CavanaghD,etal..CloningandsequencingofthegeneencodingthespikeproteinofthecoronavirusIBV.[J].JournalofGeneralVirology,1985,66(Pt4)(4):719-726.BrightlingCE,AmmitAJ,KaurD,etal..TheCXCL10/CXCR3axismediateshumanlungmastcellmigrationtoasthmaticairwaysmoothmuscle.[J].AmericanJournalofRespiratory&CriticalCareMedicine,2005,171(10):1103.CarstensEB,BallLA.RatificationvoteontaxonomicproposalstotheInternationalCommitteeonTaxonomyofViruses(2009).[J].ArchivesofVirology,2014,159(10):2831.ChaseyD,CartwrightSF.Virus-likeparticlesassociatedwithporcineepidemicdiarrhoea.[J].ResearchinVeterinaryScience,1978,25(2):255-256.ChenJF,SunDB,WangCB,etal..MolecularcharacterizationandphylogeneticanalysisofmembraneproteingenesofporcineepidemicdiarrheavirusisolatesinChina:中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第七次研讨会论文集,2008[C].ChenQ,CarrollHP,GadinaM.Thenewestinterleukins:recentadditionstotheever-growingcytokinefamily.[J].Vitamins&Hormones,2006,74(74):207-228.CollinsT,ReadMA,NeishAS,etal..Transcriptionalregulationofendothelialcelladhesionmolecules:NF-kappaBandcytokine-inducibleenhancers.[J].FasebJournal,1995,9(10):899-909.CoussementW,DucatelleR,DebouckP,etal..PathologyofexperimentalCV777coronavirusenteritisinpiglets.I.Histologicalandhistochemicalstudy[J].VeterinaryPathology,1982,19(1):46.DebouckP,PensaertM,CoussementW.Thepathogenesisofanentericinfectioninpigs,experimentallyinducedbythecoronavirus-likeagent,CV777[J].VeterinaryMicrobiology,1981,6(2):157-165.DoerflerW.DNAmethylationandgeneactivity.[J].Cell,1988,52(1):93.DucatelleR,CoussementW,DebouckP,etal..PathologyofexperimentalCV777coronavirusenteritisinpiglets.II.Electronmicroscopicstudy[J].VeterinaryPathology,1982,19(1):57.FengL,ChenJF,WangYF,etal..Spikeproteinregion(aa636～789)ofporcineepidemicdiarrheavirusisessentIalforinductionofneutralizingantibodies:中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学61 分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第七次研讨会论文集,2008[C].FengXF,ZhouBJ,ZhangSX,etal..CloningandSequenceAnalysisofORF3andMGeneofPorcineEpidemicDiarrheaVirusinGuizhouProvince[J].ChinaAnimalHusbandry&VeterinaryMedicine,2016.GeryI,GershonRK,WaksmanBH.PotentiationoftheT-lymphocyteresponsetomitogens.I.Therespondingcell[J].JournalofExperimentalMedicine,1972,136(1):128.GillisS,MizelSB.T-Celllymphomamodelfortheanalysisofinterleukin1-mediatedT-cellactivation.[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,1981,78(2):1133-1137.GordonJR,GalliSJ.MastcellsasasourceofbothpreformedandimmunologicallyinducibleTNF-α/cachectin[J].Nature,1990,346(6281):274-276.GriffithJW,SokolCL,LusterAD.ChemokinesandChemokineReceptors:PositioningCellsforHostDefenseandImmunity[J].AnnualReviewofImmunology,2014,32(1):659.HL,JG,LL,etal..SingleaminoacidchangesintheviralglycoproteinMaffectinductionofalphainterferonbythecoronavirustransmissiblegastroenteritisvirus.[J].JournalofVirology,1992,66(2):743-749.HaijemaBJ,VoldersH,RottierPJM.Live,AttenuatedCoronavirusVaccinesthroughtheDirectedDeletionofGroup-SpecificGenesProvideProtectionagainstFelineInfectiousPeritonitis[J].JournalofVirology,2004,78(8):3863-3871.HandaK,SuzukiR,MatsuiH,etal..Naturalkiller(NK)cellsasarespondertointerleukin2(IL2).II.IL2-inducedinterferongammaproduction.[J].JournalofImmunology,1983,130(2):988-992.HaringmanJJ,GerlagDM,SmeetsTJM,etal..Arandomizedcontrolledtrialwithananti-CCL2(anti–monocytechemotacticprotein1)monoclonalantibodyinpatientswithrheumatoidarthritis[M].2006.HowardM,FarrarJ,HilfikerM,etal..IdentificationofaTcell-derivedbcellgrowthfactordistinctfrominterleukin2.[J].JournalofExperimentalMedicine,1982,155(3):914.HowardM,MizelSB,LachmanL,etal..Roleofinterleukin1inanti-immunoglobulin-inducedBcellproliferation.[J].JournalofExperimentalMedicine,1983,157(5):1529-1543.IsaacsA,LindenmannJ.Virusinterference.I.Theinterferon.ByA.IsaacsandJ.Lindenmann,1957[J].JInterferonRes,1987,7(5):429-438.JinghuiF,YijingL.CloningandsequenceanalysisoftheMgeneofporcineepidemicdiarrheavirusLJB/03[J].ChineseJournalofVeterinaryMedicine,2005,30(1):69.KarinM,LinA.NF-kappaBatthecrossroadsoflifeanddeath[J].NatureImmunology,2002,3(3):221-227.KirchnerH.Interferons,agroupofmultiplelymphokines:Springerseminarsinimmunopathology,1984[C].KishimotoT.Thebiologyofinterleukin-6[J].Blood,1989,74(1):1.KocherhansR,BridgenA,AckermannM,etal..Completionoftheporcineepidemicdiarrhoea62 coronavirus(PEDV)genomesequence.[J].VirusGenes,2001,23(2):137-144.KroezeKL,JurgensWJ,DoulabiBZ,etal..Chemokine-mediatedmigrationofskin-derivedstemcells:predominantroleforCCL5/RANTES.[J].JournalofInvestigativeDermatology,2009,129(6):1569-1581.LanX,YangB,HanQY,etal..CloningandsequenceanalysisofMgeneofporcineepidemicdiarrheavirusQHstrain[J].ChineseJournalofVeterinaryScience&Technology,2005.LeblancH.Sequenceofthespikeproteinoftheporcineepidemicdiarrhoeavirus.[J].JournalofGeneralVirology,1994,75(Pt5)(75(Pt5)):1195-1200.Lee,Dong-Kyu,Park,etal..HeterogeneityinspikeproteingenesofporcineepidemicdiarrheavirusesisolatedinKorea.[J].VirusResearch,2010,149(2):175-182.LewisCE,MccarthySP,LorenzenJ,etal..DifferentialeffectsofLPS,IFN-gammaandTNFalphaonthesecretionoflysozymebyindividualhumanmononuclearphagocytes:relationshiptocellmaturity.[J].Immunology,1990,69(3):402-408.LiQ,VermaIM.NF-κBregulationintheimmunesystem[J].NatureReviewsImmunology,2002,2(12):975.LusterAD,UnkelessJC,RavetchJV.|[gamma]|-Interferontranscriptionallyregulatesanearly-responsegenecontaininghomologytoplateletproteins[J].Nature,1985,315(6021):672.MontiP,LeoneBE,MarchesiF,etal..TheCCChemokineMCP-1/CCL2inPancreaticCancerProgressionRegulationofExpressionandPotentialMechanismsofAntimalignantActivity[J].CancerResearch,2003,63(21):7451-7461.MyersJ,ThomasPR,RamirezA,etal..MethodsforInactivatingPEDVinHogTrailers[J].AnimalIndustryReport,2015.NadkarniS,MauriC,EhrensteinMR.Anti–TNF-αtherapyinducesadistinctregulatoryTcellpopulationinpatientswithrheumatoidarthritisviaTGF-β[J].JournalofExperimentalMedicine,2007,204(1):33-39.OppenheimJJ,KovacsEJ,MatsushimaK,etal..Thereismorethanoneinterleukin1[J].ImmunologyToday,1986,7(2):45-56.PanY,TianX,WeiL,etal..IsolationandcharacterizationofavariantporcineepidemicdiarrheavirusinChina[J].VirologyJournal,2012,9(1):195.ParkSJ,KimHK,SongDS,etal..Molecularcharacterizationandphylogeneticanalysisofporcineepidemicdiarrheavirus(PEDV)fieldisolatesinKorea[J].ArchivesofVirology,2011,156(4):577-585.ParkSJ,MoonHJ,LuoY,etal..CloningandfurthersequenceanalysisoftheORF3geneofwild-andattenuated-typeporcineepidemicdiarrheaviruses.[J].VirusGenes,2008,36(1):95-104.PensaertMB,DeBP.Anewcoronavirus-likeparticleassociatedwithdiarrheainswine[J].ArchivesofVirology,1978,58(3):243-247.PotterH,WeirL,LederP.Enhancer-DependentExpressionofHumanκImmunoglobulinGenesIntroducedintoMousepre-BLymphocytesbyElectroporation[J].ProceedingsoftheNational63 AcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,1984,81(22):7161.QianBZ,LiJ,ZhangH,etal..CCL2recruitsinflammatorymonocytestofacilitatebreasttumormetastasis[J].Nature,2012,475(7355):222-225.QiuPQ,HuangDX.ObservationontherapeuticeffectofINF-αandvitaminADonimmunologicfunctionin34childrenwithrecurrentrespiratoryinfections[J].JournalofXinxiangMedicalCollege,2005.řehákJ,řehákováB.Předvolebníprogramy1990:pokusografickoukomparačnianalýzuobsahů/ElectionPrograms1990:AnAttemptatGraphicComparativeAnalysisofTheirContent[J].SociologickýČasopis,1991,27(2):172-188.RookmaakerMB,VerhaarMC,deBoerHC,etal..Met-RANTESreducesendothelialprogenitorcellhomingtoactivated(glomerular)endotheliuminvitroandinvivo.[J].AmJPhysiolRenalPhysiol,2007,293(2):F624.SatonakaH,NagataD,TakahashiM,etal..InvolvementofP2Y12ReceptorinVascularSmoothMuscleInflammatoryChangesviaMCP-1UpregulationandMonocyteAdhesion.[J].AmJPhysiolHeartCircPhysiol,2015,308(8):862-2013.SenftlebenU,LiZW,BaudV,etal..IKKβIsEssentialforProtectingTCellsfromTNFα-InducedApoptosis[J].Immunity,2001,14(3):217-230.SunD,LiF,ShiH,etal..IdentificationoftwonovelBcellepitopesonporcineepidemicdiarrheavirusspikeprotein[J].VeterinaryMicrobiology,2008,131(1):73-81.SunR,LengZ,ZhaiSL,etal..GeneticVariabilityandPhylogenyofCurrentChinesePorcineEpidemicDiarrheaVirusStrainsBasedonSpike,ORF3,andMembraneGenes[J].TheScientificWorldJournal,2014,(2014-1-22),2014,2014:-.SuzukiR,HandaK,ItohK,etal..Naturalkiller(NK)cellsasarespondertointerleukin2(IL2).I.Proliferativeresponseandestablishmentofclonedcells.[J].JournalofImmunology,1983,130(2):981-987.TaniyamaT.[Interleukin-2(IL-2)].[J].NihonRinshoJapaneseJournalofClinicalMedicine,1995,53SuPt2(5):775.VennemaH,deGrootRJ,HarbourDA,etal..Primarystructureofthemembraneandnucleocapsidproteingenesoffelineinfectiousperitonitisvirusandimmunogenicityofrecombinantvacciniavirusesinkittens[J].Virology,1991,181(1):327-335.WangK,LuW,ChenJ,etal..PEDVORF3encodesanionchannelproteinandregulatesvirusproduction[J].FebsLetters,2012,586(4):384-391.WangY,LiuZ,YangT.[ChangeofserumMCP-1levelandCCR2proteinexpressioninisolatedmonocytesinpatientswithacutecoronarysyndrome][J].Zhongnandaxuexuebao.Yixueban=JournalofCentralSouthUniversity.Medicalsciences,2009,34(4):318.WatsonRD.OraladministrationofelectrolyzedwaterfortreatmentandpreventionofPEDvinswine,swineherdsandswineconfinements:WietekC,O'NeillLA.DiversityandregulationintheNF-kappaBsystem.[J].TrendsinBiochemical64 Sciences,2007,32(7):311.XiaoW.AdvancesinNF-κBSignalingTransductionandTranscription[J].中国免疫学杂志(英文版),2004,1(6):425-435.XingZ,GauldieJ,CoxG,etal..IL-6isanantiinflammatorycytokinerequiredforcontrollinglocalorsystemicacuteinflammatoryresponses.[J].JournalofClinicalInvestigation,1998,101(2):311-320.YeS,LiZ,ChenF,etal..PorcineepidemicdiarrheavirusORF3geneprolongsS-phase,facilitatesformationofvesiclesandpromotestheproliferationofattenuatedPEDV.[J].VirusGenes,2015,51(3):385-392.YuL,HouX.ConstructionofrecombinantRNAofPEDVMgeneandalphavirusvector[J].ProgressinVeterinaryMedicine,2005,26.ZhihongYU,ZhangM,WangW,etal..Effectsofflaxseedlignanonimmunemodulationoflymphocyte,macrophage,IL-2inmice[J].JournalofNortheastAgriculturalUniversity,2008,39(3):80-83.65 附录硕士期间发表的论文：王艳午，覃燕灵等.2016-2017年广东省猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP2基因遗传变异分析[J].（黑龙江畜牧兽医杂志,2018年11月见刊）Dong,J.,Wang,Y.,Yu,L.,Zhang,P.,Liu,X.,&Zhang,L.,etal.Pathogenicityofanewlyemergedrecombinedporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusstrain(subgenotypeIII)inChina[J].VeterinaryMicrobiology,2017,210:162-166.(并列第一作者)66
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