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《苯丙氨酸及其衍生物对未成熟神经元胞质游离钙的影响论文》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、苯丙氨酸及其衍生物对未成熟神经元胞质游离钙的影响论文张惠文，袁小兵，张拥军，顾学范【关键词】苯丙酮尿症【Abstract】AIM:Togainmoreinsightintothemechanismofneuronalinjuryinphenylketonuriapatientsandtoinvestigatetheeffectofphenylalanineonintracellularfreecalciumconcentration(［Ca］i)ofembryonicratcorticalneurons.MET
2、HODS:Calciumimagingmol/L)andDLβphenyllacticacid（PL,10mmol/L）decreased［Ca］i,mol/L)decreased,thenincreased,andagaindecreased［Ca］i.和FuraredTM,AM(MolecularProbeInc.)配成2mmol/L的二甲亚砜(Sigma,纯度999mL/L)溶液，分装后-20℃避光保存备用.这两种染料有相近的激发光波长（约488nm）和不同的发射光波长［Fluo4,(530±15)nm;
3、Furared(640±15)nm］.Fluo4的发射光强度随着胞内游离钙离子浓度升高而增加，而Furared的发射光强度随着胞内游离钙离子浓度升高而降低.平铺于盖玻片上的细胞在细胞外液中洗一次后，与钙指示剂Fluo4（终浓度5μmol/L）和Furared（终浓度5μmol/L）室温下孵育30min,在细胞外液中洗3次后,将细胞置于标本槽中，30min后共聚焦显微镜（LSM510,Zeiss公司，德国）载物台上观察.上述操作避光进行.标本槽为自制的方形有机玻璃皿，底部用石蜡与一薄玻片封接.药品以不同细胞外液配
4、成2倍终浓度保存，1L细胞外液,给药前均记录5min对照，然后将0.5mL的药物沿槽的边缘加入.1.4荧光图像的记录和［Ca2+］i的计算荧光图像由Zeiss激光扫描共聚焦显微成像系统记录.仪器和软件设置：40×/1.3倍油镜，激发光波长为488nm，CH3和CH4分别是针对485和635nm波长荧光信号的检测通道.激光每隔10s扫描一次细胞，扫描时间1s，每种药记录13min.通过RegionofInterest测得细胞区域CH3,CH4通道的荧光强度，计算Fluo3的发射光强度与Furared的发射光强度的
5、比值可以反映胞内游离钙的相对浓度，同时可以消除细胞几何形状对胞内钙浓度测量的影响.1.5数据处理将每1min的6张图像的比值取平均值作为该时间段胞质游离钙浓度（ci），将给药前5min记录的30张图像荧光强度的均值作为胞质游离钙的基础值（c0）,利用以下公式计算每分钟胞质游离钙随时间的变化曲线.2结果2.1苯丙氨酸对神经元胞质游离钙的影响由于神经元在静息状态下胞质游离钙有自发性的波动，当胞质内钙在基础值上下10%变化时我们不认为是药物的作用.以此作为标准，用Fluo4和Furared联合作为钙指示剂时，10~2
6、0mmol/L苯丙氨酸降低神经元胞质游离钙浓度；而当浓度降至5mmol/L时，观察不到明显的胞质游离钙变化.5~20mmol/L的酪氨酸对胞质游离钙无明显影响（结果未显示）(Fig1).2.2苯乳酸对神经元胞质游离钙的影响从Fig2可以看到高浓度苯乳酸降低胞质游离钙，当苯乳酸浓度在5mmol/L时，胞质游离钙先降低后逐渐升高，而当浓度为1mmol/L时，胞质游离钙有升高的趋势.2.3苯乙酸对神经元胞质游离钙浓度的影响10mmol/L苯乙酸使胞质游离钙降低后升高，最后又降低.加入Thapsigargin（终浓度1
7、00nmol/L）到细胞外液中，胞质内钙轻度升高.加入Thapsigagin3min后，再加入10mmol/L苯乙酸，胞质内钙持续降低，此后没有升高现象(Fig3).说明10mmol/L苯乙酸使胞质游离钙降低后升高，是因为内质网钙库释放钙离子到胞质.2.4低pH值盐酸对神经元胞质游离钙浓度的影响由于苯乙酸、苯乳酸为酸性物质，10mmol/L苯丙氨酸、苯乙酸、苯乳酸的pH值分别为7.30,4.12,3.66,为了分析苯丙氨酸、苯乙酸、苯乳酸降低神经元胞质游离钙的作用是否由于这些物质的化学特性酸性引起，我们将pH值
8、为3.66HCl溶液作用于神经元，发现胞质游离钙浓度升高(Fig4).2.5不同细胞外液条件下苯乳酸对神经元胞质游离钙浓度的影响使用无钠溶液细胞外液替换标准细胞外液，阻断神经元胞膜Na+/Ca2+交换;使用无Ca2+的细胞外液，以阻断胞外钙流入细胞内，再加入10mmol/L苯乳酸，均能使胞质游离钙降低.在无钠溶液细胞外液中，10mmol/L苯乳酸使胞质钙有短暂轻度升高(Fig5).3讨
